Changes in actin dynamics are communicated to the nucleus by members of the MRTF (myocardin related transcription factors) family of transcriptional coactivators. Upon signal induction G-actin liberates MRTF cofactors, which subsequently bind to and activate the transcription factor Serum Response Factor (SRF). SRF target genes in turn include numerous structural and regulatory components of the actin cytoskeleton as well as cytoskeleton-associated proteins involved in adhesion and cell motility. Moreover MRTFs are implicated in epithelial-mesenchymal transition (EMT), a developmentally regulated process which is also involved in tumor progression. EMT is characterized by dissociation of cell-cell contacts and a morphological conversion towards unpolarized motile cells. Together, these findings suggest a role of actin-MAL-SRF signaling in cell motility. I analyzed the migratory effects of actin-MAL mediated transcription in non-invasive cell lines and examined the regulation of MAL during EMT. An unbiased microarray screen identified Serpine1 (Pai-1) and the cytoskeleton-associated genes Four-and-a-half LIM domains 1 (Fhl1), Plakophilin 2 (Pkp2), Integrin α5 (Itga5) and Epithelial Protein Lost in Neoplasm α (Eplin-α) as novel G-actin regulated targets. I confirmed their transcriptional induction by quantitative RT-PCR. Moreover, retroviral infection with constitutively active, dominant negative and MAL knockdown constructs established these genes as MAL targets. The SRF responsive elements of Pkp2 and Eplin-α could be identified by chromatin IP and luciferase reporter assays. Functionally, I showed that ectopic expression of active MAL impairs the migration of mesenchymal NIH 3T3 fibroblasts and epithelial EpRas cells in wound healing and Boyden chamber assays. Conversely, dominant negative constructs and partial knockdown of MAL enhanced motility in these non-invasive cells. I next asked how G-actin regulated cytoskeleton-associated targets are involved in the antimigratory function of MAL in non-invasive epithelial and mesenchymal cells. Knockdown of Integrin α5 and Plakophilin 2 (Pkp2) enhanced cell migration of fibroblasts, whereas Pkp2 and Fhl1 knockdown increased epithelial cell motility. In addition the reduced migration of epithelial cells stably expressing active MAL was partially restored by knockdown of either Pkp2 or Fhl1, or by double knockdown. Overall I concluded that MAL is implicated in antimigratory responses through upregulation of the cytoskeleton-associated proteins Integrin α5, PKP2 and FHL1 in non-invasive cells. We have recently demonstrated that MAL is activated during EMT and calcium-dependent disassembly of epithelial junctions. I showed that MAL is upregulated on both mRNA and protein level upon EMT induction whereas MRTF-B expression was essentially unaffected. The microRNA miR-1 appeared to be involved in the regulation of MAL expression by binding to a highly conserved binding site in the MAL 3’UTR. Further analyses will have to determine how miR-1 contributes to the regulation of MAL during EMT induction. My findings that MAL exhibits antimigratory functions in non-invasive cell lines is contrasted by the previously described requirement of MRTFs for motility and invasion of metastatic breast cancer cells. To address the underlying discrepancies, I first reproduced the antimigratory effect of a partial Mrtf knockdown in the highly invasive MDA-MB-231 cells. In addition I could show that MAL enhances migration of invasive EpRasXT cells that have undergone EMT, which is in marked contrast to the antimigratory effect of MAL in the corresponding non-invasive epithelial EpRas cells. These findings demonstrated a fundamentally different migratory function of MRTFs in invasive and non-invasive cells. Based on these results, I hypothesize that MAL activity directly correlates with adhesive strength through its numerous cytoskeleton-associated targets. As migration speed shows a biphasic dependence on the adhesiveness I speculate that increasing MAL signaling activity in non-invasive cell lines with an already large repertoire of cytoskeletal and adhesive components reduces motility. Conversely, weakly adherent cells respond with reduced motility to decreased MAL signaling.      «

Changes in actin dynamics are communicated to the nucleus by members of the MRTF (myocardin related transcription factors) family of transcriptional coactivators. Upon signal induction G-actin liberates MRTF cofactors, which subsequently bind to and activate the transcription factor Serum Response Factor (SRF). SRF target genes in turn include numerous structural and regulatory components of the actin cytoskeleton as well as cytoskeleton-associated proteins involved in adhesion and cell motility...     »

Veränderungen der Aktin-Zytoskelett-Dynamik werden durch Koaktivatoren der MRTF (myocardin related transcription factor) Familie dem Zellkern mitgeteilt. Die Induktion der Signalkaskade resultiert in verstärkter Aktinpolymerisation, wodurch MRTFs aus einem inhibierenden Komplex mit monomerem Aktin freigesetzt werden. Daraufhin können sie an den Transkriptionsfaktor Serum Response Factor (SRF) binden und diesen aktivieren. Viele der SRF Zielgene wiederum kodieren für Zytoskelett-assoziierte Proteine, die in Adhäsion und Migration involviert sind. Darüber hinaus sind MRTFs in epithelialer-mesenchymaler Transition (EMT) involviert, einem entwicklungsregulierten Prozess, der auch zur Tumorentstehung beiträgt. EMT ist durch die Dissoziation von Zell- Zellkontakten und dem morphologischen Übergang zu unpolarisierten, motilen Zellen charakterisiert. Insgesamt deuten diese Befunde auf eine Rolle des Aktin-MAL Signaltransduktionswegs in Zellmotilität hin. In dieser Arbeit untersuchte ich, welchen Einfluss Aktin-MAL vermittelte Transkription auf die Migration nicht-invasiver Zellen hat. Des Weiteren analysierte ich die Regulation von MAL während der EMT. In einem Microarray Screen wurden Serpine1 (Pai-1) und die Zytoskelett-assoziierten Faktoren Four-and-a-half LIM domains 1(Fhl1), Plakophilin 2 (Pkp2), Integrin α5 (Itga5) und Epithelial Protein Lost in Neoplasm α (Eplin-α) als neue G-Aktin regulierte Gene identifiziert. Ich konnte die transkriptionelle Induktion dieser Gene mittels quantitativer RT-PCR verifizieren. Durch retrovirale Infektion mit konstitutiv aktiven, dominant negativen und MAL-Knockdownkonstrukten wurden diese Gene als MAL Zielgene charakterisiert. Die SRF-responsiven Elemente von Pkp2 und Eplin-α konnten durch Chromatin IP und Luciferase Assays identifiziert werden. Ich zeigte, dass die Überexpression von aktivem MAL die Migration mesenchymaler NIH 3T3 Zellen und epithelialer EpRas Zellen in Wundheilungs- und Boyden-Kammer-Assays beeinträchtigt. Dominant negative und MAL knockdown Konstrukte hingegen verstärkten die Motilität dieser nicht-invasiven Zellen. Danach untersuchte ich, wie G-actin regulierte Gene mit Zytoskelett-assoziierten Funktionen zu dem antimigratorischen Effekt von MAL in nicht-invasiven epithelialen und mesenchymalen Zellen beitragen. Tatsächlich erhöhte der Knockdown von Integrin α5 und Plakophilin 2 die Migration von Fibroblasten, während Pkp2- und Fhl1-Knockdown epitheliale Zellmotilität verstärkte. Darüber hinaus wurde die verringerte Migration von epithelialen Zellen, die aktives MAL stabil exprimieren, durch den Knockdown von Pkp2 und/oder Fhl1 partiell aufgehoben. Insgesamt schließe ich, dass MAL durch die Hochregulierung der Zytoskelett-assoziierten Proteine Integrin α5, PKP2 und FHL1 eine antimigratorische Funktion in nicht invasiven Zellen ausübt. Wir konnten kürzlich zeigen, dass MAL während der EMT und Kalzium-abhängiger Auflösung epithelialer Zellkontakte aktiviert wird. Ich zeigte in meiner Arbeit, dass MAL auf mRNA- und Protein-Ebene nach EMT Induktion hochreguliert wird, während die MRTF-B Expression im Wesentlichen unbeeinflusst bleibt. Die microRNA miR-1 scheint in die Regulation der MAL Expression involviert zu sein, in dem sie an eine hoch konservierte Bindestelle in der 3’UTR der MAL II. Zusammenfassung 10 mRNA bindet. Weitere Untersuchungen werden zeigen müssen, ob miR-1 zu der Regulation von MAL während der EMT Induktion beiträgt. Mein Befund, dass MAL antimigratorische Funktionen in nicht-invasiven Zelllinien ausübt, steht der kürzlich beschriebenen Notwendigkeit von MRTFs für Motilität und Invasivität metastasierender Brustkrebszellen gegenüber. Um die zugrundeliegenden Ursachen zu untersuchen, reproduzierte ich zunächst den antimigratorische Effekt eines partiellen Mrtf Knockdowns in den hoch invasiven MDAMB- 231 Zellen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass MAL die Migration invasiver EpRasXT Zellen, die eine epitheliale-mesenchymale Transition durchlaufen haben, verstärkt. Dies steht in klarem Gegensatz zu dem antimigratorischen Effekt von MAL in den entsprechenden nicht-invasiven epithelialen EpRas Zellen. Diese Ergebnisse zeigen eine prinzipiell unterschiedliche migratorische Funktion von MRTFs in invasiven und nicht-invasiven Zellen. Basierend auf den Ergebnissen vermute ich, dass die MAL Aktivität durch die zahlreichen Zytoskelett-assoziierten Zielgene direkt mit der Adhäsionsstärke korreliert. Da die Migrationsgeschwindigkeit eine biphasische Abhängigkeit von der Adhäsivität zeigt, spekuliere ich, dass eine Erhöhung der MAL Signalaktivität in nicht-invasiven Zelllinien, die bereits mit einem großen Repertoire an zytoskelettalen und adhäsiven Komponenten ausgestattet sind, die Motilität verringert. Im Gegensatz dazu antworten weniger adhärente Zellen mit verringerter Motilität auf verminderte MAL Aktivität.      «

Veränderungen der Aktin-Zytoskelett-Dynamik werden durch Koaktivatoren der MRTF (myocardin related transcription factor) Familie dem Zellkern mitgeteilt. Die Induktion der Signalkaskade resultiert in verstärkter Aktinpolymerisation, wodurch MRTFs aus einem inhibierenden Komplex mit monomerem Aktin freigesetzt werden. Daraufhin können sie an den Transkriptionsfaktor Serum Response Factor (SRF) binden und diesen aktivieren. Viele der SRF Zielgene wiederum kodieren für Zytoskelett-assoziierte Prote...     »