Original title:
A Proteomics View of Quorum-Sensing Regulated and Surface Induced Genes in Representative Pseudomonas and Burkholderia species
Translated title:
Vergleichende Proteomanalysen zur Identifizierung oberflächen-induzierter und quorum-sensing-regulierter Gene repräsentativer Vertreter der Gattungen Pseudomonas und Burkholderia
Author:
Arevalo-Ferro, Catalina Year:
2004
Document type:
Dissertation
Faculty/School:
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan
Advisor:
Riedel, K. (Dr.)
Referee:
Schleifer, K.-H. (Univ.-Prof. Dr.); Görg, A. (apl.-Prof. Dr.)
Format:
Text
Language:
en
Subject group:
BIO Biowissenschaften
Keywords:
Proteomics; Pseudomonas sp.; Burkholderia sp.; Quorum-sensing; Biofilm
Translated keywords:
Proteomanalyse; Pseudomonas sp.; Burkholderia sp.; Quorum-sensing; Biofilm
TUM classification:
BIO 310d; BIO 220d; BIO 180d
Abstract:
In many bacteria quorum-sensing (QS) regulates a wide variety of phenotypes. The presented work comprises a global study of QS controlled and surface-induced genes of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida and Burkholderia cenocepacia by comparative proteome analysis. Different extraction protocols for intracellular, surface and extracellular proteins were established and the expression patterns were compared by means of two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). P. aeruginosa utilizes two interrelated QS systems (las and rhl), which interact with additional regulators including Vfr and GacA, to regulate the expression of many phenotypes. A global analysis of the QS regulon showed that 23.7% of all detected protein spots were differentially expressed between the PAO1 parent strain and the isogenic lasI rhlI double mutant, it was suggested that QS control also operates via post-transcriptional mechanisms. Among the identified proteins, some already known QS regulated and importantly nineteen novel QS regulated proteins were found, many of which are involved in iron utilization, suggesting a link between QS and the iron regulatory system. Since the ability to scavenge iron from host proteins contributes to the infection process, these results are supporting the impact of QS on the pathogenicity. Furthermore, it was shown that the effect of Vfr and GacA on QS controlled gene expression is conspicuously lower than expected. It is known that QS plays a significant role in the pathogenicity of P. aeruginosa. The contribution of QS to the pathogenic competence of strains isolated from the sputa of two CF-patients was also studied. A second part of this work addressed the identification of QS regulated proteins of B. cenocepacia H111, another important pathogen involved in cystic fibrosis. B. cenocepacia employs the cep QS system to control the expression of virulence factors and biofilm formation. In total about 6% of the B. cenocepacia proteome was differentially expressed between wild type and QS mutant. These results indicate that QS represents a global regulatory system in B. cenocepacia. Nineteen proteins were identified by N-terminal sequence analysis, among them important factors such as AidA and the major subunit of type I pili, FimA. Finally, surface-induced and quorum-sensing regulated proteins of P. putida IsoF were identified. P. putida biofilms were grown in silicone tubes under permanent medium flow and it was shown that the biofilm mode of growth has a significant effect on protein expression comparing biofilm and planktonic cultures. P. putida IsoF employs the ppu QS system to control gene expression, in this work it was shown that 11% of the P. putida IsoF surface-subproteome was differentially expressed between wild type and QS mutant. Additionally it was found that QS has a stimulating impact on the maturation of biofilms in P. putida IsoF.
« Translated abstract:
In der Natur kommen Mikroorganismen meist in Form von Oberflächen-lokalisierten Zellverbänden, so genannten Biofilmen, vor. Für die Ausbildung und Architektur komplexer Konsortien spielt interzelluläre Kommunikation mittels frei diffundierbarer Signalmoleküle (N-Acyl-L-homoserinlactone = AHL) in einem Prozess, der als Quorum sensing (QS) bezeichnet wird, eine wesentliche Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst Quorum sensing regulierte Gene der opportunistisch pathogenen Bakterien Burkholderia cenocepacia und Pseudomonas aeruginosa mittels vergleichender Proteomanalysen von Wildtypstämmen und AHL-defizienten Mutanten identifiziert. Hierzu wurden zytoplasmatische, Oberflächen-assoziierte und extrazelluläre Proteine spezifisch extrahiert. Anschließend wurden die Proteinfraktionen elektrophoretisch aufgetrennt und differentiell exprimierte Proteine durch Sequenzierung des N-Terminus oder massenspektrometrische Analysen mit nachfolgendem Datenbankabgleich identifiziert. B. cenocepacia kontrolliert die Expression verschiedener extrazellulärer Faktoren sowie die Ausbildung von Biofilmen durch das AHL-abhängige cep QS-System. In Vorarbeiten wurde mittels Knockout-Mutagenese eine definierte cepI Mutante erzeugt. Mithilfe der vergleichenden Proteomanalyse wurde gezeigt, dass in B. cenocepacia die Expression von 6% aller detektierbaren Proteine durch das QS-System kontrolliert wird. Dabei wurde unter anderem ein Protein identifiziert, das Sequenzähnlichkeit zu FimA aus Escherichia coli, einem Typ I Fimbrien-Strukturprotein, aufweist. Die AHL-kontrollierte Expression dieses Adhäsins könnte erklären, warum die Ausbildung von Biofilmen in B. cenocepacia von einem funktionell intakten Zell-Zell-Kommunikationssystem abhängt. P. aeruginosa verwendet zwei miteinander agierende QS-System (las und rhl), die zudem unter der Kontrolle weiterer Superregulatoren wie Vfr und GacA stehen, um die Expression einer Vielzahl von Virulenzfaktoren und die Ausbildung von Biofilmen in Abhängigkeit von der Zelldichte zu steuern. Eine globale Analyse des QS-Regulons auf Proteomebene zeigte, dass 24% aller detektierbaren Proteine unter der Kontrolle der QS-Kaskade stehen. Die im Vergleich zum Anteil an AHL-regulierten Genen (6%) überraschend hohe Zahl regulierter Proteine unterstreicht die Bedeutung von QS als globalem Regulationssystem und lässt vermuten, dass das QS-System auch auf post-transkriptioneller Ebene fungiert. Unter den als AHL-regulierten identifizierten Proteinen befinden sich viele bekanntermaßen QS-regulierte Virulenzfaktoren, darüber hinaus wurden 17 bisher unbekannte QS-regulierte Proteine identifiziert, von denen viele eine wichtige Funktion bei der Akquisition von Eisen ausüben. Eine Untersuchung des Einflusses der potentiellen QS-Superregulatoren GacA und Vfr auf die Expression QS-regulierter Phänotypen zeigte, dass der Einfluss von Knockout-Mutationen in den entsprechenden Genen auf die Expression AHL-regulierter Gene wesentlich geringer ist als erwartet. Die postulierte Funktion von GacA und Vfr als globale Regulatoren konnte somit zumindest auf Proteomebene nicht bestätigt werden. In einem weiteren Teilprojekt wurde die intraklonale Diversität zweier klonaler P. aeruginosa Varianten, TB10839 und TB121838, untersucht. Beide Stämme wurden aus dem Sputum von Mukoviszidose-Patienten isoliert, unterscheiden sich jedoch dramatisch hinsichtlich ihrer Virulenz. Eine vergleichende Proteomanalyse beider Stämme ergab, dass ca. 4% der Proteine differentiell exprimiert werden, darunter viele QS-regulierte Virulenzfaktoren, was die signifikant erhöhte Virulenz von TB10839 erklären könnte. Am Beispiel des Rhizobakteriums Pseudomomas putida wurde schließlich untersucht, welche Bedeutung der Kommunikation mittels AHL Signalmolekülen für die Besiedelung von Oberflächen zukommt. Die Identifizierung entsprechender Proteine erfolgte mittels vergleichender Proteomanalyse von Wildtyp und QS-defizienten Mutanten bzw. von planktonischen und Oberflächen-assoziierten Bakterien. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Expression von 11% aller detektierbaren Oberflächenproteine von P. putida AHL-abhängig ist und ein signifikanter Anteil der QS-regulierten Proteine bei der Ausbildung von Biofilmen verstärkt exprimiert wird. Damit steht fest, dass QS als globaler Regulator in P. putida fungiert und eine wesentliche Rolle beim Oberflächen-assoziierten Wachstum dieses Rhizosphären-Isolates spielt.
« Publication :
Universitätsbibliothek der TU München
WWW:
https://mediatum.ub.tum.de/?id=603431 Date of submission:
19.04.2004
Oral examination:
16.04.2004
Controlled terms:
Pseudomonas Biofilm Zellkommunikation Proteomanalyse; Burkholderia Biofilm Zellkommunikation Proteomanalyse
File size:
50182347 bytes
Pages:
136
Urn (citeable URL):
https://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:91-diss2004041611348 Last change:
27.06.2005
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