Endolysine (Ply) sind zellwandhydrolysierende Enzyme, welche am Ende eines Phagenzyklus die Freisetzung der neugebildeten Phagen ermöglichen. Am FML Weihenstephan (Institut für Mikrobiologie) wurden die Endolysine-Gene ply118 und ply511 aus den Listeria monocytogenes Bakteriophagen A118 bzw. A115 isoliert und sequenziert. Ply118 codiert für eine L-Alanyl-D-Glutaminsäure Peptidase, wohingegen Ply511 als N-Acetylmuramyl-L-Alanin Amidase innerhalb des Peptidoglycans die Verbindung zwischen N-Acetyl-D-Muraminsäure und der Aminosäure L-Alanin spaltet. Beide Enzyme führen zur raschen Lyse von Listeria Zellen. Listeria monocytogenes ist ein ubiquitär vorkommendes Gram-positives Stäbchen, welches als fakultativer Krankheitserreger in Rohmilchprodukten auftreten kann. Das grundlegende Ziel dieser Arbeit war eine Expression dieser Endolysine in Starter- und Reifungskulturen, um einen wirkungsvollen Schutz gegen Listeria Kontaminationen in gefährdeten Lebensmittel zu haben. Als Modellorganismen wurden Lactococcus lactis und Penicillium camemberti ausgewählt. Für die Expression der Endolysin-Gene ply511 und ply118 in Lactococcus wurde ein Expressionsvektor konstruiert. Für die Transkription in Lactococcus wurden die drei Lactococcus Promotoren P21, P32 und P59 ausgewählt und getestet. Zuerst wurden die Expressionskassetten P21-ply118, P32-ply118 und P59-ply118 im E. coli Vektor pBluescript II (-SK) konstruiert und anschließend in den Lactococcus-E. coli Shuttle Vektor pTRKH2 kloniert. Die daraus resultierenden Expressionsvektoren wurden pLC-PL118-P21, pLC-PL118-P32 und pLC-PL118-P59 genannt. Promotor P32 lieferte die beste Ply118 Expression in Lactococcus. Daher wurde das Endolysin Ply511 ebenfalls unter die Kontrolle dieses Promotors gestellt. Der Ply511 Expressionsvektor (pLC-PL511) wurde erfolgreich in Lactococcus transformiert. Um jedoch einen extrazellulären Export ins Medium zu erreichen wurde mit Hilfe des Signalpeptids SPSlpA aus Lactobacillus brevis mit beiden Endolysinen eine Sekretionskassette konstruiert. Zur Überprüfung des Konstruktes wurde mit der Staphylococcus aureus Nuklease als Reporterenzym ebenfalls eine Fusion mit dem Signalpeptid durchgeführt. Die drei Sekretionskassetten wurden anschließend stromabwärts zum Promotor P32 in pTRKH2 kloniert und in Lactococcus transformiert. Sowohl Ply511 als auch die Nuklease konnten im Überstand nachgewiesen werden. Eine C-terminale Deletion von 80 Aminosäuren im Ply511 führte zu einer verstärkten lytischen Aktivität des sekretierten Endolysins. Es konnten keine Transformanten gefunden werden, welche Ply118 aktiv sekretierten. Eine Sekretion dieses Endolysins scheint toxisch für Lactococcus lactis zu sein (GAENG et al. 2000) Für die Expression des ply118-Gens in Penicillium camemberti wurde der Shuttelvektor pELN5 ausgewählt. Dieser Vektor verfügt über einen starken Promotor aus Aspergillus nidulans. Durch die Klonierung des Endolysins entstand der Pilz-Expressionsvektor pELN118. Die Konstruktion dieses Vektors wurde ebenfalls in E. coli durchgeführt. Da keinerlei Selektionsmarker für P. camemberti auf diesem Expressionsvektor vorhanden ist, wurde eine Kotransformation mit den Plasmiden pELN118 und p3SR2 durchgeführt. p3SR2 enthält als dominantes Markergen amdS aus Apergillus nidulans. Dieses Gen kodiert für eine Acetamidase, welche Acetamid spaltet und als Stickstoffquelle zugänglich macht. Die Integration des Endolysin Gens in das Genom wurde über PCR und Southern Blot Analysen nachgewiesen. Zum Nachweis der Expression wurden bei den positiv getesteten Transformanten eine Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) durchgeführt. Zwar konnte die Endolysin mRNA nachgewiesen werden, jedoch war es nicht möglich das Endolysin über Western-Blotting oder Platten-Diffusions-Test nachzuweisen. Gründe dafür könnten die ungenügende Stabilität der mRNA oder die Degradierung des rekombinanten Phagenlysins durch intra- und extrazelluläre Pilzproteasen sein.     «

Endolysine (Ply) sind zellwandhydrolysierende Enzyme, welche am Ende eines Phagenzyklus die Freisetzung der neugebildeten Phagen ermöglichen. Am FML Weihenstephan (Institut für Mikrobiologie) wurden die Endolysine-Gene ply118 und ply511 aus den Listeria monocytogenes Bakteriophagen A118 bzw. A115 isoliert und sequenziert. Ply118 codiert für eine L-Alanyl-D-Glutaminsäure Peptidase, wohingegen Ply511 als N-Acetylmuramyl-L-Alanin Amidase innerhalb des Peptidoglycans die Verbindung zwischen N-Acetyl...     »

Endolysins are page encoded cell wall lytic enzymes which are synthesized late during the virus multiplication and mediate the release of progeny phages. At the Institute of Microbiology, FML Weihenstephan two endolysin genes (ply118 and ply511) were isolated and sequenzed from the Listeria monocytogenes bacteriophages A118 and A511. Ply118 is a L-alanoyl-D-glutamate peptidase and Ply511 acts as N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. Both enzymes induce a rapid lysis of Listeria cells. Listeria monocytogenes is a widely distributed, gram-positive rod and causes foodborne diseases in dairy products. The expression and secretion of these lysins in starter and ripening organisms such as Lactococcus lactis and Penicillium camemberti might be a possibility for a "natural protection" against Listeria monocytogenes contaminations in dairy products. For the expression of these endolysin genes ply118 and ply511 in Lactococcus an expression vector was constructed. The three lactococcal promoters P21, P32 and P59 were selected for transcription. First, the expression-cassettes P21-ply118, P32-ply118 and P59-ply118 were created into the E. coli vector pBluescript II (-SK) and subsequently cloned into the Lactococcus-E. coli shuttle vector pTRKH2. These new constructed Lactococcus expression vectors were called pLC-PL118-P21, pLC-PL118-P32 and pLC-PL118-P59. The Lactococcus lactis strain carrying pLC-PL118-P32 reaches the highest level of Ply118 expression. On the basis of this result, the endolysin ply511 was cloned under the control of promoter P32. The Ply511 expression vector was named pLC-PL511. High levels of active enzymes were produced and accumulated in the cytoplasmic cell fractions but were not released from the cell at significant levels. Furthermore the endolysin-genes ply118 and ply511 were fused with the SPslpA nucleotid sequence encoding the Lactobacillus brevis S-layer protein signal peptide. As a positive control for the construction the Staphylococcus aureus nuclease, truncated of its own signalsequence was also fused with SPslpA. Expression of SPslpA-ply511 and SPslpA-DSPnuc from pSL-PL511 and pSL-DSPNuc, respectively, resulted in the secretion of both enzymes by L. lactis cells. One clone expressed an unusually strong lytic activity, which was found to be due a 115 bp deletion occured within the 3'-end coding sequence. No active Lactococcus transformants carrying pSL-PL118 were detectable (GAENG et al., 2000) Plasmid pELN5 is an integrating mold expression vector, carrying a E. coli ori (origin of replication) and a constitutive promoter from the Aspergillus nidulans ATP synthase subunit 9 gene oliC31. Ply118 was inserted downstream of the promoter and the resulting plasmid pELN118 was co-transformed into Penicillium camemberti, along with the selectable plasmid p3SR2 carrying the dominant amdS marker gene of Aspergillus nidulans. Selection was carried out on minimal plates with acetamid as sole N-source. Chromosomal integration of the co-transformed vector in Penicillium was verified by PCR amplification and Southern blot analysis. With RT-PCR the endolysin mRNA was detected. Nevertheless no possibility existed to monitor the translation of the active enzyme by western-blotting or plate diffusion tests. This may have be due to very low levels of translation, or degradation of the protein by fungal proteases     «

Endolysins are page encoded cell wall lytic enzymes which are synthesized late during the virus multiplication and mediate the release of progeny phages. At the Institute of Microbiology, FML Weihenstephan two endolysin genes (ply118 and ply511) were isolated and sequenzed from the Listeria monocytogenes bacteriophages A118 and A511. Ply118 is a L-alanoyl-D-glutamate peptidase and Ply511 acts as N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. Both enzymes induce a rapid lysis of Listeria cells. Listeria mon...     »