In Pflanzen ist die Aminosäure Tryptophan zusätzlich zu ihrer Rolle in der Proteinbiosynthese Ausgangspunkt für die Synthese zahlreicher Phytohormone und Sekundärmetabolite. Potentielle Kandidatengene wurden auf eine Beteiligung am Tryptophansynthase-Komplex in Mais hin untersucht. Dieser Komplex katalysiert die Bildung von Indol aus Indol-3-Glycerinphosphat (alpha-Reaktion) und die Kondensation von Indol und Serin zu Tryptophan (beta-Reaktion) und ist aus den Untereinheiten alpha-beta-beta-alpha aufgebaut. Der Tryptophansynthase-Komplex wurde in Blattextrakten aus Wildtyp-Mais durch Größenausschlusschromatographie untersucht. Ein ~155 kDa-Komplex mit Tryptophansynthase-Aktivität und ein ~95 kDa-Komplex mit beta-Aktivität ließen sich nachweisen. alpha-Aktivität ist im Komplex, aber auch in einer monomerischen Fraktion (~30 kDa) messbar. Diese Aktivität tritt in der Zmbx1-Mutante nicht auf und ist daher wohl eher ZmBX1-Enzymen als freien alpha-Untereinheiten zuzuschreiben. Die Genprodukte von ZmTSAlike2 und ZmTSB1 bilden in vitro einen Tryptophansynthase-Komplex. Typischerweise wird in diesem Komplex die katalytische Effizienz der alpha-Reaktion im Vergleich zu freiem alpha stark gesteigert. Ein wichtiges Tryptophanderivat im Pflanzenreich ist das am häufigsten vorkommende Auxin Indol-3-Essigsäure (IAA). IAA ist an zahlreichen Prozessen wie Apikaldominanz, Seitenwurzelbildung, Embryonalentwicklung und Tropismen beteiligt. Maiskornextrakte setzten Tryptophan mit einer Rate von 0,5 pmol mg-1 min-1 zu IAA um. Durch Gelfiltration wurde ein 180 kDa großer, putativer IAA-Synthase-Komplex nachgewiesen. Diese IAA-Synthase-Aktivität in Mais konnte lediglich 64fach angereichert werden. Weitere Aufreinigungsversuche scheiterten am schnellen Aktivitätsverlust, so dass keine Aussagen über die Zusammensetzung des Komplexes möglich waren. Als Kandidatengene der Auxinbiosynthese in Mais (Zea mays) wurden neben einer Amidase (ZmAmi1) auch zwei Nitrilasegene (ZmNit1 und ZmNit2) isoliert, die untereinander 73% Übereinstimmung in ihrer Aminosäuresequenz aufweisen. Heterolog exprimiertes ZmNIT2 ist in der Lage verschiedene Nitrile umzusetzen, wobei das Enzym für den Umsatz von Indol-3-Acetonitril (IAN) in IAA die beste katalytische Effizienz zeigt. Nitrilaseprotein und endogene Nitrilaseaktivität, wie auch das Substrat IAN sind in Maiskörnern und in Primärwurzel- und Koleoptilenspitzen junger Keimlinge nachweisbar. In IAN-haltigem Wasser gezogene Maiskeimlinge haben eine erhöhte Nitrilaseexpression und zeigen Auxin-typische Effekte wie verkürzte Wurzeln. Um die Bedeutung der Hydrolyse von IAN zu IAA durch ZmNIT2 in vivo nachzuweisen, wurden Zmnit2-knock-out-Mutanten untersucht. Diese sind weniger sensitiv gegenüber exogen zugegebenem IAN und weisen deutlich verkürzte Primärwurzeln und signifikant weniger Gesamt-IAA in Korn und jungen Primärwurzelspitzen auf als der Wildtyp. Expression von ZmNIT2, Enzymparameter und Mutantenphänotyp machen eine Beteiligung dieser Nitrilase an der Auxinbiosynthese im Korn und jungen Primärwurzeln wahrscheinlich. ZmNIT1 zeigt in vitro mit verschiedenen getesteten Nitrilverbindungen keine Aktivität und die Mutante weist keinen Auxinphänotyp auf. In vitro bilden ZmNIT1 und ZmNIT2 hochmolekulare heteromere Komplexe, die neben IAN auch beta-Cyanoalanin, das als Intermediat der Cyanid-Detoxifikation diskutiert wird, hydrolysieren.     «

In Pflanzen ist die Aminosäure Tryptophan zusätzlich zu ihrer Rolle in der Proteinbiosynthese Ausgangspunkt für die Synthese zahlreicher Phytohormone und Sekundärmetabolite. Potentielle Kandidatengene wurden auf eine Beteiligung am Tryptophansynthase-Komplex in Mais hin untersucht. Dieser Komplex katalysiert die Bildung von Indol aus Indol-3-Glycerinphosphat (alpha-Reaktion) und die Kondensation von Indol und Serin zu Tryptophan (beta-Reaktion) und ist aus den Untereinheiten alpha-beta-beta-alph...     »

In addition to its role in protein synthesis tryptophan is a precursor in the synthesis of a large variety of phytohormones and plant secondary metabolites. Potential candidate genes were tested for involvement in a tryptophan synthase complex in maize. This complex catalyses the formation of indole from indole-3-glycerol phosphate (alpha-reaction) and the condensation of indole and serine to tryptophan (beta-reaction) and is formed out of alpha-beta-beta-alpha subunits. The tryptophan synthase complex was investigated in wildtype maize leaf extracts via size exclusion chromatography. A ~155 kDa complex with tryptophan synthase activity and a ~95 kDa complex with beta-activity were detected. alpha-activity is measurable in the complex as well as in a monomeric fraction. As this activity is not present in the Zmbx1 mutant this conversion should be rather due to the ZmBX1 enzyme than to free alpha-subunits. In vitro the gene products of ZmTSAlike2 and ZmTSB1 form a tryptophan synthase complex. In this complex the catalytic efficiency of alpha-activity is typically strongly increased in comparison to free alpha. An important tryptophan derivative in the plant kingdom is the most abundant auxin indole-3-acetic acid (IAA). IAA is involved in numerous plant processes including apical dominance, lateral root formation, embryo development, and tropisms. Protein preparations of maize kernels are capable of converting tryptophan to IAA at a rate of 0.5 pmol mg-1 min-1. Gel filtration purification suggests that this turnover is due to an app. 180 kDa protein complex. This IAA synthase activity could only be enriched 64-fold. As further purification attempts failed due to a severe loss in enzyme activity, no information about complex composition could be obtained. As candidate genes for auxin biosynthesis in maize (Zea mays) we isolated an amidase (ZmAmi1) as well as two nitrilase genes, ZmNit1 and ZmNit2, that both share 73% sequence identity on the amino acid level. Heterologously expressed ZmNIT2 hydrolyzes various nitrile compounds showing particularly high catalytic efficiency for the conversion of indole-3-acetonitrile (IAN) to IAA. Nitrilase protein and endogenous nitrilase activity are present in maize kernels and the tips of primary root and coleoptile of young seedlings together with the substrate IAN. Maize seedlings grown in water containing IAN showed increased nitrilase expression and typical auxin-like effects, e.g. decreased root length. To provide evidence for the hydrolysis of IAN to IAA by ZmNIT2 in vivo Zmnit2 knock-out mutants were analyzed. These mutants came out to be less sensitive towards exogenous applied IAN and showed significantly decreased primary root length as well as total IAA amount in kernel and young primary root tips compared to the wildtype. Because of ZmNIT2 expression, enzymatic parameters, and mutant phenotype a role of this nitrilase in auxin biosynthesis in kernel and early primary root development is likely. ZmNIT1 shows no in vitro activity with several tested nitrile compounds and the corresponding mutant no auxin phenotype. In vitro ZmNIT1 and ZmNIT2 form a high-molecular-weight heteromeric complex that is able to hydrolyze IAN and beta-cyanoalanine, which is discussed as an intermediate in cyanide detoxification.      «

In addition to its role in protein synthesis tryptophan is a precursor in the synthesis of a large variety of phytohormones and plant secondary metabolites. Potential candidate genes were tested for involvement in a tryptophan synthase complex in maize. This complex catalyses the formation of indole from indole-3-glycerol phosphate (alpha-reaction) and the condensation of indole and serine to tryptophan (beta-reaction) and is formed out of alpha-beta-beta-alpha subunits. The tryptophan synthase...     »