Die quantitative Reverse-Transkription mit Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) ist eine neue Methode, um geringste mRNA Mengen in biologischen Proben zuverlässig zu bestimmen. Da die Stärke der Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes proportional zur gebildeten DNA-Menge sein sollte, ermöglicht die Aufnahme der Fluoreszenz eine Darstellung des gesamten Reaktionsverlaufs. Demnach kann aus diesem Reaktionsverlauf ein Rückschluss auf die eigentliche Ausgangskonzentration der mRNA gezogen werden. Während der RNA-Extraktion können hemmende Substanzen mit isoliert werden, die im Folgenden die Reverse-Transkription (RT) als auch die PCR inhibieren und somit zu einem probenspezifischen Verlauf der Reaktion führen. Zusätzlich variiert die PCR-Effizienz nicht nur zwischen zwei Proben, sondern auch während der Registrierung der PCR-Kurve einer einzelnen Probe. Aus diesem Grund ist die korrekte Bestimmung der PCR-Effizienz jeder einzelnen Probe wie auch eine zweckmäßige Standardisierung der Expressionsrohwerte eine wichtige Voraussetzung für die korrekte Interpretation der Ergebnisse. Um eine Lösung dieser Probleme zu finden, wurde eine Reihe von biologischen Versuchen durchgeführt, in denen die RNA aus verschiedenen Geweben von Schaf und Rind, so wie auch aus Zellkultur-Leukozyten extrahiert wurde. Eine konstante Menge der RNA wurde dann in die cDNA übersetzt. Alle PCR-Läufe wurden mittels eines LightCyclers durchgeführt und die Fluoreszenzrohdaten direkt von der LightCycler Software gespeichert. Mit Hilfe dieser biologischen Daten wurden mathematische Modelle sowie statistische Verfahren entwickelt und validiert, mit denen man den optimalen Quantifizierungsbereich ermitteln, die Effizienz der real-time PCR erstmals exakt bestimmen, die Heterogenität zwischen experimentellen Proben untersuchen und somit die Qualität der Expressionsergebnisse verfeinern kann. Aufbauend auf diese Standardisierungen, wurde ein Entscheidungsalgorithmus für die zweckmäßige Auswertung der qRT-PCR Daten entwickelt.     «

Die quantitative Reverse-Transkription mit Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) ist eine neue Methode, um geringste mRNA Mengen in biologischen Proben zuverlässig zu bestimmen. Da die Stärke der Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes proportional zur gebildeten DNA-Menge sein sollte, ermöglicht die Aufnahme der Fluoreszenz eine Darstellung des gesamten Reaktionsverlaufs. Demnach kann aus diesem Reaktionsverlauf ein Rückschluss auf die eigentliche Ausgangskonzentration der mRNA gezogen werden. Währen...     »

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) is a new method for reliable quantification of low-abundance mRNA in biological samples. Since the strength of the fluorescence signal emitted by the report dye is proportional to the produced DNA amount, the fluorescence monitoring enables visualisation of the full reaction trajectory. The reaction trajectory can be then extrapolated back to an input concentration. RNA extraction can introduce unwanted contaminants into the sample, inhibiting the reverse transcription (RT) as well as the PCR reaction. These inhibitions cause then the reaction to precede sample-specific. In addition, the amplification efficiency varies not only between samples, but also along the recorded amplification trajectory of a single sample. Consequently, a correct determination of each probe’s PCR efficiency as well as a good standardization of the raw expression estimators is of great importance for a correct interpretation of results. To find a solution to above problems a series of biological experiments with RNA extracted from various ovine and bovine tissues and from cultured leukocytes was carried out. Constant amount of RNA was then reverse–transcribed to cDNA. All PCR runs were performed on a LightCycler instrument and Fluorescence data was saved in the LightCycler software. Based on this data, mathematical models together with statistical procedures were developed and validated. These can investigate the optimal quantification range and exactly determine its real-time PCR efficiency. Additionally, methods were developed to disclose heterogeneity between probes. All these procedures contribute to better quality of results obtained. Resulting from these standardisations, a decision algorithm for a proper analysis of the qRT-PCR data was designed.     «

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) is a new method for reliable quantification of low-abundance mRNA in biological samples. Since the strength of the fluorescence signal emitted by the report dye is proportional to the produced DNA amount, the fluorescence monitoring enables visualisation of the full reaction trajectory. The reaction trajectory can be then extrapolated back to an input concentration. RNA extraction can introduce unwanted contaminants into the sample, inhi...     »