17beta-hydroxysteroid dehydrogenase (17beta-HSD) type 1 and type 3 function as estrogen and androgen activity regulators, respectively, thereby playing key roles in sexual differentiation, pregnancy and sex-steroid associated types of cancers in mammals. Although in non-mammalian vertebrates similar functions of the respective sex-steroids have been reported, there is still only little information available on enzymes which metabolize and regulate these substances. In this work the identification and characterization of the zebrafish homologs of 17beta-HSD type 1 and type 3 is described. In silico screens of available EST and genomic databases yielded a set of candidate sequences, which were successively complemented to give rise to the full-length coding sequences. For 17beta-HSD type 1 and type 3 three putative zebrafish homologs each were obtained. To the respective human and mouse homologs they displayed a highly similar exon architecture and shared about 50-60% identical amino acids. Thorough subsequent analyses on DNA, RNA and protein level were carried out to identify the true homolog among the candidate sequences. In this way, zebrafish 17beta-HSD type 1 (zfHSD 1) and two closely related, paralogous photoreceptor-associated retinol dehydrogenases (zfprRDH 1 and zfprRDH 2) were identified. Expression analyses during embryogenesis and in tissues of adult male and female fish revealed specific expression patterns for each zebrafish gene. In this respect, zfHSD 1 was highly similar to the mammalian 17beta-HSDs type 1 whereas from the two zfprRDHs only type 1 resembled an expression profile similar to its mammalian homolog and type 2 displayed widespread expression. Phylogenetic analyses supported the affiliation of the zebrafish proteins to the respective enzyme groups and suggested the duplicated zfprRDH to be fish-specific and absent in other vertebrates. These analyses identified a close evolutionary connection between 17beta-HSDs type 1 and retinol dehydrogenases, which was further highlighted by dissection of 17beta-HSDs type 1 and prRDHs on protein level. Sequence analyses revealed residues and conserved elements typical for each enzyme group. Furthermore, presence and integrity of structural and functional motifs of the short-chain dehydrogenase/reductase family suggested all three zebrafish enzymes to be functional and similar to their mammalian homologs. This aspect was more closely investigated by homology modeling, based on the crystal structure of the human enzyme. Several amino acids important in recognition and binding of cofactor and substrate, and essential for the catalytic mechanism were identified. Structural differences to the closely related zfprRDHs especially affecting the substrate binding part were outlined and one highly conserved amino acid close to the catalytic center suggested to function in retinoid-steroid discrimination. Activity measurements on recombinant zebrafish wild type zfHSD 1, zfprRDH 1 and zfprRDH 2 supported the notion that, in spite of their close relation, only the first of these enzymes was capable of catalyzing the reduction of estrone to estradiol, characteristic for all so far analyzed 17beta-HSDs type 1. Furthermore, mutation of the aforementioned amino acid hypothesized to be involved in substrate discrimination in all three enzymes did reduce catalytic activity in zfHSD 1 whereas the two zfprRDHs did not show an increased affinity towards steroids. Concerning the 17beta-HSD type 3 candidates, extensive analyses revealed the zebrafish homolog (zfHSD 3) and two closely related paralogous forms of 17beta-HSD type 12. Phylogenetic analyses highlighted the close and complex evolution of both groups identifying 17beta-HSD type 12 as the ancient, fatty acid metabolising progenitor of vertebrate 17beta-HSDs type 3. Unlike in case of zfHSD 1, zfHSD 3 had an expression profile different to that of its mammalian homolog. It is discussed that this may be a leftover of its fatty acid synthesizing ancestor or might be caused by involvement of zfHSD 3 in several related functions that in mammals are taken over by additional enzymes.     «

17beta-hydroxysteroid dehydrogenase (17beta-HSD) type 1 and type 3 function as estrogen and androgen activity regulators, respectively, thereby playing key roles in sexual differentiation, pregnancy and sex-steroid associated types of cancers in mammals. Although in non-mammalian vertebrates similar functions of the respective sex-steroids have been reported, there is still only little information available on enzymes which metabolize and regulate these substances. In this work the identificatio...     »

Die 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenasen (17beta-HSD) Typ 1 und Typ 3 fungieren als Regulatoren der Aktivität von Estrogenen bzw. Androgenen und spielen somit eine zentrale Rolle in der sexuellen Differenzierung, Schwangerschaft und in den Sexsteroid-assoziierten Formen von Krebs in Säugern. Obgleich in anderen Vertebraten über ähnliche Funktionen der jeweiligen Sexsteroide berichtet wurde, ist nur wenig über die entsprechenden Enzyme, die diese Substanzen metabolisieren und regulieren, bekannt. In dieser Arbeit ist die Identifizierung und Charakterisierung der Zebrafisch-Homologen von 17beta-HSD Typ 1 und Typ 3 beschrieben. In silico Screens auf den verfügbaren EST- und genomischen Datenbanken führten zu einer Anzahl an Kandidaten-Sequenzen, die sukzessive vervollständigt wurden, um die kompletten kodierenden Sequenzen zu erhalten. Für 17beta-HSD Typ 1 und Typ 3 wurden auf diese Weise je drei mögliche Zebrafisch-Homologe identifiziert. Diese wiesen im Vergleich zu den jeweiligen Maus- und Mensch-Homologen eine sehr ähnliche Exon-Struktur auf und zeigten auf Protein-Ebene eine Aminosäure-Identität von ca. 50-60%. Um das wahre Zebrafisch-Homologe unter diesen Kandidaten-Sequenzen zu identifizieren, wurden nachfolgend gründliche Untersuchungen auf DNA-, RNA- und Protein-Ebene durchgeführt. Auf diese Weise konnte die Zebrafisch 17beta-HSD Typ 1 (zfHSD 1), sowie zwei hierzu nahe verwandte, paraloge Photorezeptor-assoziierte Retinol Dehydrogenasen (zfprRDH 1 und zfprRDH 2) identifiziert werden. Expressions-Analysen während der Embryogenese und in Geweben erwachsener, männlicher und weiblicher Fische ergaben spezifische Expressions-Muster für jedes Zebrafisch-Gen. Im Vergleich zu den jeweiligen Säuger-Homologen zeigte zfHSD 1 eine sehr hohe Ähnlichkeit, wohingegen nur Typ 1 der beiden zfprRDHs ein vergleichbares Expressions-Profil aufwies; zfprRDH 2 hingegen zeigte eine nahezu ubiquitäre Expression. Phylogenetische Analysen unterstützten die Zugehörigkeit der Zebrafisch-Proteine zu den jeweiligen Enzym-Gruppen und ließen vermuten, dass die beobachtete Duplizierung von zfprRDH Fisch-spezifisch und abwesend in anderen Vertebraten sei. Diese Untersuchungen identifizierten eine enge, evolutionäre Beziehung zwischen 17beta-HSDs Typ 1 und Retinol Dehydrogenasen, welche durch die eingehende Analyse dieser Enzyme auf Protein-Ebene noch hervorgehoben wurde. Sequenz-Analysen zeigten Aminosäuren und konservierte Elemente auf, die typisch für die jeweilige Enzymgruppe sind. Zudem ließ die Anwesenheit und Integrität von strukturellen und funktionellen Motiven der short-chain dehydrogenase/reductase Familie vermuten, dass alle drei Zebrafisch-Enzyme funktionell und in dieser Hinsicht ihren Säuger-Homologen ähnlich seien. Dieser Aspekt wurde noch eingehender durch Homologie-Modellierung, basierend auf der Kristallstruktur der menschlichen 17beta-HSD Typ 1, untersucht. Eine Anzahl von Aminosäuren, die wichtig für die Erkennung und Bindung von Cofaktor und Substrat und essentiell für den katalytischen Mechanismus sind, konnte identifiziert werden. Strukturelle Unterschiede zu den nahe verwandten zfprRDHs, die insbesondere den Substrat-Bindenden Teil betreffen, wurden herausgearbeitet; eine hoch konservierte Aminosäure wurde in unmittelbarer Nähe zum katalytischen Zentrum identifiziert und spekuliert, dass diese eine Rolle in der Unterscheidung zwischen Retinoid- und Steroid-Substraten spielen könnte. Aktivitätsmessungen mit den rekombinanten, wildtypischen Zebrafisch-Proteinen zfHSD 1, zfprRDH 1 und zfprRDH 2 unterstützten die Annahme, dass trotz der nahen Verwandtschaft nur das erste dieser Enzyme die Reduktion von Estron zu Estradiol, eine Reaktion die charakteristisch für alle bislang analysierten 17beta-HSDs Typ 1 ist, katalysierte. Des Weiteren führte die Mutation der zuvor erwähnten Aminosäure, evtl. beteiligt an der Substrat-Unterscheidung, in allen drei Enzymen zu einer Reduktion der katalytischen Aktivität in zfHSD 1, während die beiden zfprRDHs keine erhöhte Affinität zu Steroiden zeigten. Im Falle der 17beta-HSD Typ 3 Kandidaten führten die umfangreichen Analysen zur Identifizierung des Zebrafisch-Homologen (zfHSD 3), sowie zwei hierzu nahe verwandten, paralogen Formen der 17beta-HSD Typ 12. Phylogenetische Analysen enthüllten eine vielschichtige und komplexe Evolution beider Gruppen und identifizierten 17beta-HSD Typ 12 als den Fettsäuren metabolisierenden Vorläufer der 17beta-HSD Typ 3 der Vertebraten. Im Gegensatz zu zfHSD 1 wies das Expressions-Profil von zfHSD 3 deutliche Unterschiede zu dem des Säuger-Homologen auf. Dieser Befund wurde als ein Rudiment des Fettsäure metabolisierenden evolutiven Ursprungs diskutiert; alternativ wurde die Ausübung verschiedener, verwandter Funktionen von zfHSD 3, die in Säugern von zusätzlichen Enzymen ausgeführt werden, in Betracht gezogen.     «

Die 17beta-Hydroxysteroid Dehydrogenasen (17beta-HSD) Typ 1 und Typ 3 fungieren als Regulatoren der Aktivität von Estrogenen bzw. Androgenen und spielen somit eine zentrale Rolle in der sexuellen Differenzierung, Schwangerschaft und in den Sexsteroid-assoziierten Formen von Krebs in Säugern. Obgleich in anderen Vertebraten über ähnliche Funktionen der jeweiligen Sexsteroide berichtet wurde, ist nur wenig über die entsprechenden Enzyme, die diese Substanzen metabolisieren und regulieren, bekannt....     »