Eine Punktmutation im mitochondrialen Cytochrom b Gen von pilzlichen Phytopathogenen verleiht Resistenz gegenüber QoI Fungizide. Diese Mutation verursacht einen Aminosäurenaustausch von Glycin durch Alanin an der Position 143 im Cytochrom b Protein, das in der pilzlichen Zellatmung beteiligt ist. Obwohl weitere Resistenzmechanismen beschrieben worden sind, ist die G143A Mutation bei allen pilzlichen Schaderregern die mit Abstand effektivste und am weitesten verbreitete Form von QoI Resistenz. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten molekulare Diagnosesysteme zur Detektion dieser Punktmutation im mitochondrialen Cytochrom b Gen bei verschiedenen pilzlichen Phytopathogenen etabliert werden. Diese Markersysteme wurden anschließend auf ihre Eignung als Routinediagnosesystem in einem Fungizidresistenzmonitoring beurteilt. Ferner erfolgte eine Evaluierung der quantitativen Detektionsleistung dieser Markersysteme zur Identifikation resistenter Allele in Feldmischproben. Mit einer CAPS Analyse konnte die G143A Mutation in Einzelsporenisolaten von B. graminis f.sp. tritici, B. graminis f.sp. hordei und Venturia inaequalis zuverlässig detektiert werden. Eine Identifikation von resistenten Allelen bis zu einem relativen Anteil von 10-50% in Feldmischproben ist mit der CAPS Analyse möglich. Der hohe Arbeitsaufwand bei diesem Markertyp erlaubt allerdings keinen Einsatz als Routinediagnosesystem mit hohem Probendurchsatz. Ein allel-spezifischer PCR Marker erlaubte eine schnelle qualitative Detektion der G143A Mutation in Einzelsporenisolaten von B. graminis f.sp. tritici. Als Routinediagnosesystem für die G143A Mutation wurde die DHPLC Analyse bei B. graminis f.sp. tritici, B. graminis f.sp. hordei, Venturia inaequalis, Septoria tritici und Plasmopara viticola eingerichtet. Die DHPLC Technik erlaubte eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Genotypisierung von SNP Allelen bei einer starken Automatisierung aller Arbeitsschritte. Eine Detektion von resistenten Allelen in Feldmischproben war mit diesem Markersystem mit Ausnahme von Plasmopara viticola bei allen untersuchten Pathogene bis zu einem relativen Anteil von 20% möglich. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden im Herbst 2002 mit der DHPLC Analyse erstmals Feldisolate von Septoria tritici identifiziert, die eine G143A Mutation besitzen. Die entsprechende Punktmutation im Cytochrom b Gen konnte durch Sequenzanalysen bestätigt werden. Die DHPLC Analyse wird als Routinediagnosesystem zur Detektion von weiteren Punktmutationen vorgeschlagen, die in pilzlichen Phytopathogenen Fungizidresistenz verursachen. Zur Detektion sehr geringer Frequenzen QoI resistenter Allele in Feldmischproben von Plasmopara viticola wurde eine quantitative allel-spezifische PCR Analyse etabliert. Neben dem allel-spezifischen ARMS PCR System diente ein Referenz PCR System zur Nivellierung unterschiedlicher Cytochrom b Kopien in den DNA Lösungen von Feldproben. Mit einem optimierten DNA Isolationsverfahren konnte aus getrockneten infizierten Weinblättern Gesamt DNA gewonnen werden, bei der keinerlei Matrixeffekte in der PCR Amplifikation auftreten. Von beiden Allelen wurden klonierte Plasmidstandards hergestellt. Ausführliche Untersuchungen bestätigten eine identische Amplifikationskinetik bei klonierten und genomischen DNA Standards. Zur Quantifizierung resistenter Allele in anonymen Feldmischproben konnten demzufolge klonierte Kalibrationsstandards verwendet werden. Durch den Einsatz von klonierten Standards wird eine schnelle und kostengünstige Quantifizierung resistenter Allele ermöglicht. Aus Verdünnungsreihen mit relativen Anteilen resistenter Allele von 100% - 0,001% resultierten Gesamt PCR Effizienzen von 0,87. Die Kalibrierfunktionen erreichten eine hohe Präzision mit Bestimmtheitsmaßen von durchschnittlich 0,995. Die Berechnung von Vertrauensbereichen der Kalibrationsstufen bei der quantitativen allel-spezifischen PCR Analyse geschah nach DIN 53804-1. Über den gesamten Messbereich betrug die relative Ergebnisunsicherheit weniger als 33%. Die Berechnung von Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erfolgte nach der Leerwertmethode der DIN 32645. Die Nachweisgrenze der quantitativen allel-spezifischen PCR Analyse betrug 92 resistente Kopien. Dies entspricht einem relativen Anteil von 0,0003% resistenter Allele in Feldmischproben von Plasmopara viticola. Die Bestimmungsgrenze, ab der resistente Allele quantifiziert werden können, betrug 162 Kopien. Dies entspricht einem relativen Anteil von 0,0005% resistenter Allele in der DNA Lösung. Mit der quantitativen allel-spezifischen PCR Analyse steht ein kostengünstiges neues Analysenverfahren für ein Resistenzmonitoring mit hohem Probendurchsatz und bisher nicht erreichter Sensitivität zur Verfügung. Einige wenige resistente Genotypen in großen Mengen infizierten Probenmaterials, beispielsweise aus der Beprobung einer kompletten Anbauregion, können mit diesem Diagnosesystem in nur einer einzigen Analyse identifiziert werden.
«
Eine Punktmutation im mitochondrialen Cytochrom b Gen von pilzlichen Phytopathogenen verleiht Resistenz gegenüber QoI Fungizide. Diese Mutation verursacht einen Aminosäurenaustausch von Glycin durch Alanin an der Position 143 im Cytochrom b Protein, das in der pilzlichen Zellatmung beteiligt ist. Obwohl weitere Resistenzmechanismen beschrieben worden sind, ist die G143A Mutation bei allen pilzlichen Schaderregern die mit Abstand effektivste und am weitesten verbreitete Form von QoI Resistenz. Im...
»
Login
BibTeX