Das Retinoblastoma Tumor Supressor Protein pRb ist ein Phosphoprotein des Zellkerns, das als negativer Regulator der zellulären Proliferation und Apoptose fungiert und ein Promoter der Zelldifferenzierung ist. Alle seine physiologischen Funktionen wurden aufgrund seiner Fähigkeit beschrieben, mit einem Großteil der zellulären und viralen Onkoproteine zu interagieren. Detaillierte strukturelle und funktionelle Analysen von pRb wurde dadurch erschwert, dass das saubere Protein fehlte. Diese Arbeit berichtet über den Aufbau, die Expression und die Dreischrittreinigung der A/B-Taschenregion des pRb in einem bakteriellen Expressionssystem. Das Protokoll erlaubt die Produktion von 5-6 mg/l sauberem ungelabeltem pRb und 3-4 mg/l isotopen-gelabeltem pRb in einer E. coli-Kultur. Die molekulare Mase des gereinigten Proteins wurde aufgrund von SDS-PAGE und Gel filtration auf ca. 39 kDa geschätzt. N-terminale Aminosäurenanalyse und Westernblotuntersuchungen wurden benutzt, um das aus E. coli gereinigte humane pRb zu charakterisieren. Die Sekundär- und Tertiärstruktur wurden durch CD-Messungen und NMR-Spektroskopie überprüft. Die Präparation von pRB, über die hier berichtet wird, liefert ausreichende Mengen von diesem Protein für eine detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Reinoblasmaproteins. Das isotopen-gelabelte Protein kann benutzt werden, um die vorgeschlagenen pRb Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen, wie auch für Strukturbestimmung und drug-design. Das ungelabelte Protein kann benutzt werden, um Komplexe von pRb und seiner Partnerproteine zu machen. Das Lösen der Kristallstrukturen dieser Komplexe mag den Handlungsmechanismus des pRb in verschiedenen zellulären Prozessen erklären. Eine Anwendung dieser Arbeit ist die Untersuchung der Interaktion zwischen pRb und MyoD. MyoD gehört zu einer Gruppe von muskelspezifischen, helix-loop-helix Motif zeigende Transkriptionsfaktoren, welche essentiell für die Differenzierung von Muskelzellen in Vertebraten sind. Vorangegangene Studien zeigten daß MyoD mit der sog small pocket domain von pRb interagiert. Durch spezifische Binde-Essays und NMR Titrationen konnten wir mit unserer Arbeit zeigen, daß die small pocket domain des Retinoblastoma-proteins nicht mit MyoD in vitro interagiert, wie Vorangegangene Studien zeigten. Calpaine sind Cysteinproteasen, die in der calciumvermittelten Signaltransduktion, der Apoptose und degenerativen Krankheiten eine Rolle spielen. Calpaine sind wichtig für die Regulation des Zellzyklus, aber Regeln, die die Calpainspaltungsspezifität erklären, sind wenig verstanden. Diese Arbeit berichtet über in vitro Untersuchungen des Schemas der Calpain-Proteolyse des p19INK4d Proteins, einem cyclinabhängigen cdk4/6 Inhibitors, der den Zellzyklus von Säugern negativ reguliert. Die Daten, die hier vorgestellt werden, zeigen neue Eigenschaften der Calpain-Aktion: Calpaine schneiden p19INK4d unmittelbar nach stabilen α-helikalen Segmenten im Protein, aber nicht notwendigerweise bei Resten der Linkerpolypeptidsegmente, die am meisten dem Lösungsmittel zugänglich sind oder die hoch flexibel sind. Dies steht im Gegensatz zu Eigenschaften der Calpaine, die im Zusammenhang mit der Spezifität der Calpaine für ihre Substrate beobachtet wurden. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass cdk6 nicht von Calpain geschnitten wird, was impliziert, dass Calpain in den Zellzyklus eingebunden sein kann, um den regulatorischen Proteinumsatz durch Cycline und cdk-Inhibitoren zu regeln.
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Das Retinoblastoma Tumor Supressor Protein pRb ist ein Phosphoprotein des Zellkerns, das als negativer Regulator der zellulären Proliferation und Apoptose fungiert und ein Promoter der Zelldifferenzierung ist. Alle seine physiologischen Funktionen wurden aufgrund seiner Fähigkeit beschrieben, mit einem Großteil der zellulären und viralen Onkoproteine zu interagieren. Detaillierte strukturelle und funktionelle Analysen von pRb wurde dadurch erschwert, dass das saubere Protein fehlte. Diese Arbeit...
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