Acute leukemia (AL) is a hematopoietic malignancy with unsatisfactory prognosis, particularly in adults and upon relapse. Thus, novel options for treatment are intensively required. Towards this aim, it is of major importance to identify and validate structures within tumor cells which harbor an essential function and might serve as therapeutic targets, especially in patients’ individual tumor cells and in an in vivo setting. Here, we aimed at establishing novel techniques enabling to knockdown target genes in patient-derived xenograft (PDX) AL cells expanding in mice. This task is challenging as PDX AL cells are reluctant to proliferate in vitro and belong to the most difficult type to transfect. We selected a microRNA (miR-30) backbone to directly couple the shRNA transcription to the expression of a reporter gene under the control of a single promoter. For highly sensitive and reliable experiments, we decided for a competitive approach monitored by fluorochrome markers. Our newly established knockdown strategy induced a strong and stable reduction of the anti-apoptotic protein XIAP by well more than 90%. The inhibition of XIAP induced a proliferative disadvantage in both AL cell lines and PDX AL cells in vivo, indicating for the first time that XIAP harbors an essential function for PDX AL cells expanding in mice. To extend our analyses to strongly essential targets which would not allow the production of PDX AL cells with a stable knockdown, we designed a system for inducible knockdown. Here, we expressed an inducible form of the Cre recombinase CreERT2 and flanked the miR-30 cassette with two different pairs of loxP sites to enable their recombination by Tamoxifen. Using this novel technique, we could show that the loss-of-function of the anti-apoptotic protein Mcl-1 is responsible for proliferation disadvantage of PDX AL cells expanding in mice, proving Mcl-1 as important putative therapeutic target in AL. Taken together, we established innovative molecular techniques, enabling silencing any desired gene both in vitro and in vivo in PDX AL cells in order to identify and validate therapeutic targets and leading to novel treatment approaches for AL in the future.      «

Acute leukemia (AL) is a hematopoietic malignancy with unsatisfactory prognosis, particularly in adults and upon relapse. Thus, novel options for treatment are intensively required. Towards this aim, it is of major importance to identify and validate structures within tumor cells which harbor an essential function and might serve as therapeutic targets, especially in patients’ individual tumor cells and in an in vivo setting. Here, we aimed at establishing novel techniques enabling to knockdown...     »

Die akute Leukämie (AL) ist ein hämatopoetischer Tumor mit schlechter Prognose, vor allem bei Erwachsenen und im Rezidiv, und bedarf dringend neuer therapeutischer Optionen. So ist es von höchster Wichtigkeit, Strukturen in Leukämie-Zellen zu identifizieren und zu validieren, die eine essentielle Funktion für den Tumor besitzen und als neue therapeutische Zielstrukturen dienen können, vor allen in individuellen Zellen einzelner Patienten und in der in vivo Situation. Hier setzen wir uns das Ziel, neue Techniken zu etablieren, die es ermöglichen, einen Knockdown von Zielgenen in Patient-abgeleiteten Xenograft (PDX) AL Zellen durchzuführen, während diese in Mäusen wachsen. Dies stellt eine große Herausforderung dar, weil PDX AL Zellen nicht in vitro wachsen und sich ausgesprochen schlecht transfizieren lassen. Um die Expression der shRNA direkt mit der Expression eines Reporter-Proteins unter dem gleichen Promotor zu verknüpfen, wählten wir einen mikro RNA 30 (miR-30) Hintergrund. Um sehr seneitive und zuverlässige Experimente durchführen zu können, entschieden wir uns für einen Fluorochrom-markierten kompetitiven Ansatz. Unsere neu etablierte Knockdown Strategie ermöglichte eine starke und stabile Reduktion des anti-apoptotischen Proteins XIAP zu mehr als 90%. Die Reduktion der XIAP Expression führte zu einem Wachstums-Nachteil sowohl von ALL Zellinien, als auch von PDX AL Zellen in vivo, was erstmalig nahelegt, dass XIAP eine essentielle Funktion für das Wachstum von PDX AL Zellen in der Maus besitzt. Um unsere Analysen auf stark essentielle Zielstrukturen auszuweiten, die keine Herstellung von PDX AL Zellen mit stabilem Knockdown erlauben würden, entwarfen wir ein System des induzierbaren Knockdowns. Hierzu exprimierten wir eine induzierbare Form der Cre Rekombinase und setzten die miR-30 Kassette zwischen zwei unterschiedlichen Paare von loxP Stellen, so dass die miR-30 Kassette erst durch Zugabe von Tamoxifen exprimiert wurde. Mit Hilfe dieses neuen Ansatzes konnten wir zeigen, dass ein Verlust der Funktion des anti-apoptotischen Proteins Mcl-1 die Proliferation von PDX AL Zellen in Mäusen verhindert, so dass Mcl-1 eine attraktives therapeutisches Zielstruktur für die AL darstellt. Zusammen genommen etablierten wir neue molekulare Techniken, die grundsätzlich die Expression jedes interessierenden Gene in PDX AL Zellen in vitro und in vivo ermöglicht und damit erlaubt, therapeutische Zielstrukturen zu identifizieren und zu validieren, was zu neuen therapeutischen Ansätzen für die AL in der Zukunft führen sollte.      «

Die akute Leukämie (AL) ist ein hämatopoetischer Tumor mit schlechter Prognose, vor allem bei Erwachsenen und im Rezidiv, und bedarf dringend neuer therapeutischer Optionen. So ist es von höchster Wichtigkeit, Strukturen in Leukämie-Zellen zu identifizieren und zu validieren, die eine essentielle Funktion für den Tumor besitzen und als neue therapeutische Zielstrukturen dienen können, vor allen in individuellen Zellen einzelner Patienten und in der in vivo Situation. Hier setzen wir uns das Zie...     »