Allergieerkrankungen gewinnen in der heutigen Gesellschaft zunehmend an Bedeutung. Sie beruhen auf einer Überreaktion des körpereigenen Immunsystems, die ihren Ausdruck in verschiedenen Krankheitsbildern, wie beispielsweise Heuschnupfen oder Asthma, findet. Wesentlich beteiligt an einer allergischen Reaktion sind Mastzellen, die überall dort zu finden sind, wo sich der Körper im direkten Kontakt zur Außenwelt befindet. Nach deren Aktivierung entlassen sie den Inhalt ihrer Mastzell-Granula, der hauptsächlich aus Tryptasen besteht, in die unmittelbare Zell-Umgebung. Viele Studien lassen einen engen Zusammenhang von Tryptase-Aktivität und Asthma-Erkrankung vermuten ? ein Umstand, der eine genaue strukturelle Untersuchung von Tryptasen erfordert. Humane Mastzell-Tryptasen repräsentieren eine Unterfamilie der Trypsin-artigen Serinproteinasen. Mehrere Tryptase-Isoformen sind auf genomischer Basis identifiziert worden, unter ihnen die a-Tryptasen aI und aII und die b-Tryptasen bIa, bIb, bII und bIII. Während die b-Tryptasen als vollständig aktive Serinproteinasen mit einer Trypsin-artigen Spezifität charakterisiert worden sind, konnte für a-Tryptasen bisher kein Substrat identifiziert werden. a-Tryptasen werden daher als inaktiv angesehen. Im Rahmen dieser Arbeit sind Vertreter dieser beiden Tryptase-Familien strukturell und biochemisch untersucht worden. b-Tryptasen bilden die vorherrschende Tryptase-Art in den Mastzell-Granula. Ihre wesentliche Rolle in diversen allergischen Erkrankungen macht deren selektive Inhibition zu einem wichtigen pharmakologischen Ziel. Hier werden die Kristallstrukturen der bisher ungelösten b-Tryptase-Isoformen bIa und bIII im Komplex mit den drei bifunktionalen Inhibitoren NS222, BYK76935 und BYK150640 vorgestellt. Hierbei konnte der bisher lediglich postulierte, durch Heparin-Bindung stabilisierte, rahmenartige Aufbau des b?Tryptase-Tetramers, bei dem die aktiven Zentren der vier beteiligten Monomere in die zentrale Pore zeigen, bewiesen werden. Die genaue Kenntnis der relativen Lage der aktiven Zentren eröffnet zugleich die Möglichkeit, spezielle bivalente und daher besonders selektive Tryptase-Inhibitoren zu entwickeln. Erstmalig konnte die wahrhaft bifunktionale Inhibitor-Bindung an zwei benachbarte aktive Zentren des b-Tryptase-Tetramers strukturell nachgewiesen werden. Für BYK76935 wurde ein unerwartet neuer bifunktionaler Bindungsmodus gezeigt. Die Kristallstrukturen der drei Inhibitoren im Komplex mit den b-Tryptase Isoformen liefern wertvolle Erkenntnisse für die weitere Optimierung der vorhandenen Leitstrukturen und eröffnen zusätzlich neue Perspektiven für das Design einer neuen Klasse von Tryptase-Inhibitoren. Als Mitglied der a-Tryptasen, der vorwiegenden Tryptase-Isoform in Basophilen, ist die Struktur der aI-Tryptase gelöst worden. Sie besitzt eine ähnliche, wenn auch ungleich stabilere Tetramerarchitektur wie die b-Tryptasen. Strukturell liegt diese erhöhte Tetramer-Stabilität in relativ kleinen Variationen im A-B-Interface begründet. Besonders auffällig ist das ?aktive? Zentrum der aI-Tryptase, das in einer bisher in Serinproteinasen noch nie beobachteten, inaktiven Konformation vorliegt. In starkem Kontrast zu anderen Trypsin-artigen Serinproteinasen verläuft das Ser214-Gly219-Segment, das normalerweise für die antiparallele Substratbindung verantwortlich ist, zick-zack-artig quer über die Substratbindungs-Region und blockiert hierbei sämtliche Substrat-Bindungstaschen. Daß a-Tryptasen aber dennoch aktiviert werden können, wurde in dieser Arbeit gezeigt. Eine solche Aktivierung muß mit einer Umordnung des inaktiven ?aktiven? Zentrums der a-Tryptasen einhergehen. Kinetische Untersuchungen mit den peptidischen Substraten N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA und N-Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA erlaubten es, diese Tryptase-Isoform als eine sehr langsame Proteinase zu charakterisieren. Es wird daher ein Mechanismus postuliert, nach dem die Substrateinwirkung, möglicherweise zusätzlich durch Interaktion mit einer Exosite, die Umlagerung der inaktiven Form der aI-Tryptase in eine proteolytisch aktive Form bewirkt.     «

Allergieerkrankungen gewinnen in der heutigen Gesellschaft zunehmend an Bedeutung. Sie beruhen auf einer Überreaktion des körpereigenen Immunsystems, die ihren Ausdruck in verschiedenen Krankheitsbildern, wie beispielsweise Heuschnupfen oder Asthma, findet. Wesentlich beteiligt an einer allergischen Reaktion sind Mastzellen, die überall dort zu finden sind, wo sich der Körper im direkten Kontakt zur Außenwelt befindet. Nach deren Aktivierung entlassen sie den Inhalt ihrer Mastzell-Granula, der h...     »

In society today allergic diseases become more and more important. They are based on an over activity of the immune system resulting in a variety of clinical conditions ranging from rhinitis to asthma. A major player within the allergic reaction are mast cells, that are located everywhere, where the body is in direct contact with the environment. Upon their activation they release the content of the mast cell granula, which mainly consists of tryptases, into the surrounding medium. Many studies allow to propose a tight connection between tryptase activity and asthma, a situation, that demands a close structural investigation of tryptases. Human mast cell tryptases represent a sub-family of trypsin-like serine proteinases. Several tryptase isoforms have been identified on the genomic level, among them the a-tryptases aI and aII and the b-tryptases bIa, bIb, bII and bIII. While b-tryptases are characterized as fully active serine proteinase with a trypsin-like specificity, no substrate could be identified for a-tryptases, so far. Hence a-tryptases are considered inactive. In this dissertation members of both tryptase-families were structurally and biochemically investigated. b-Tryptases represent the predominant tryptase isoform in the mast cell granula. Their major role in several allergic disorders makes their selective inhibition an important pharmaceutical goal. Here, the crystal structures of the so far unsolved b-tryptase isoforms bIa and bIII are presented in complex with the three bifunctional inhibitors NS222, BYK76935 and BYK150640. The until now only postulated, heparin-stabilized frame-like tetrameric assembly of the b?tryptase monomers with their active sites directed into the central pore could be proved. Knowing the exact relative position of the active sites within the tetramer provides the unique possibility of designing bifunctional inhibitors to span the gap between them. For the first time, a truly bifunctional binding mode to two neighbouring active sites could be shown crystallographically. Unexpectedly, for BYK76935 a novel bifunctional binding mode was discovered. The crystal structures of all three inhibitors in complex with the b-tryptase isoforms provide valuable Information for further improvement of the present lead compounds and additionally open up new perspectives towards the design of a new class of tryptase inhibitors. As a member of the predominant tryptase family in basophils, a-tryptases, the crystal structure of aI-tryptase was solved. aI-Tryptase possesses a similar, even though far more stabile, tetramer architecture as b-tryptases. This increased stability is structurally based on small differences within the A-B interface. Very apparent is the ?active? site of aI-tryptase which is arranged in a conformation, that has never been observed in serine proteinases. In stark contrast to other trypsin-like serine proteinases the Ser214-Gly219 segment, that normally provides for the antiparallel substrate binding now runs zig-zag-like across the substrate binding region and thereby blocks all substrate binding pockets. In this dissertation is was shown, that a-tryptase can nevertheless be an active proteinase. Such an activation involves a reorganization of the inactive ?active? site of a-Tryptase. Kinetic investigations with the model-substrates N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA and N-Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNA allowed it to characterize this tryptase isoform as a very slow proteinase. Hence a mechanism is postulated, in which the interaction with the correct substrate, possibly involving interaction within an exosites, causes a rearrangement of the inactive form of aI-tryptase into a proteolytically active form.     «

In society today allergic diseases become more and more important. They are based on an over activity of the immune system resulting in a variety of clinical conditions ranging from rhinitis to asthma. A major player within the allergic reaction are mast cells, that are located everywhere, where the body is in direct contact with the environment. Upon their activation they release the content of the mast cell granula, which mainly consists of tryptases, into the surrounding medium. Many studies...     »