The retinoblastoma tumor suppressor protein, pRb, is a nuclear phosphoprotein that acts as a negative regulator of cellular proliferation and apoptosis, and a promoter of cell differentiation. All of its physiological functions were ascribed based on its ability to interact with a plethora of cellular and viral oncoproteins. However, detailed structural and functional analysis of pRb has been hampered by a lack of pure protein. In the presented thesis, we report the construction, expression and three-step purification of the A/B pocket region of pRb in a bacterial expression system. Our protocol allows the production of 5-6 mg of pure unlabelled pRb and 3-4 mg of isotopic labelled pRb per liter of E. coli culture. The molecular mass of the purified protein was estimated to be ~39 kDa by SDS-PAGE and gel filtration. N-terminal amino acid analysis and Western blot studies were used to characterize the E. coli purified human pRb. The secondary and tertiary structural integrity of the protein was investigated by CD and NMR spectroscopy. The preparation of pRb reported here provides sufficient amounts of this protein for a detailed functional and structural characterization of the retinoblastoma protein. The isotopic labelled protein can be used to validate proposed pRb protein-protein interactions as well as for structure determination and drug design. The unlabelled protein can be used to make complexes of pRb and its partner proteins, and solving crystal structures of these complexes may explain the mechanism of action of pRb in various cellular processes. As an application of this work, we have probed interactions between pRb and MyoD. MyoD belongs to a group of muscle specific basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors that are essential for muscle cell differentiation in vertebrates. Preceding studies showed interaction of MyoD with the small pocket domain of pRb. Through pull-down assays and NMR titrations, here we demonstrate that the small pocket domain of retinoblastoma protein does not interact with MyoD in vitro as previous studies reported. Calpains are cysteine proteases implicated in Ca2+ mediated signal transduction, apoptosis and degenerative diseases. Calpains play a role in the cell cycle regulation, but the physiological function of calpains in the cell cycle and rules that govern calpain cleavage specificity are poorly understood. We report here in this thesis in vitro studies on the pattern of calpain proteolysis of the p19INK4d protein, a cyclin-dependent CDK4/6 inhibitor that negatively regulates the mammalian cell cycle. The data presented here show new characteristics of calpain action: calpains cleave p19INK4d immediately after stable α-helical segments of the protein, but not necessarily at residues of linker polypeptide segments that are most exposed to solvent or that have high flexibility, in contrast to features observed so far in the specificity of calpains for their substrates. We also observed that CDK6 is not cleaved by calpain, suggesting that calpain may be involved in the cell cycle by regulating the cell cycle regulatory protein turnover through cyclins and CDK inhibitors.     «

The retinoblastoma tumor suppressor protein, pRb, is a nuclear phosphoprotein that acts as a negative regulator of cellular proliferation and apoptosis, and a promoter of cell differentiation. All of its physiological functions were ascribed based on its ability to interact with a plethora of cellular and viral oncoproteins. However, detailed structural and functional analysis of pRb has been hampered by a lack of pure protein. In the presented thesis, we report the construction, expression and...     »

Das Retinoblastoma Tumor Supressor Protein pRb ist ein Phosphoprotein des Zellkerns, das als negativer Regulator der zellulären Proliferation und Apoptose fungiert und ein Promoter der Zelldifferenzierung ist. Alle seine physiologischen Funktionen wurden aufgrund seiner Fähigkeit beschrieben, mit einem Großteil der zellulären und viralen Onkoproteine zu interagieren. Detaillierte strukturelle und funktionelle Analysen von pRb wurde dadurch erschwert, dass das saubere Protein fehlte. Diese Arbeit berichtet über den Aufbau, die Expression und die Dreischrittreinigung der A/B-Taschenregion des pRb in einem bakteriellen Expressionssystem. Das Protokoll erlaubt die Produktion von 5-6 mg/l sauberem ungelabeltem pRb und 3-4 mg/l isotopen-gelabeltem pRb in einer E. coli-Kultur. Die molekulare Mase des gereinigten Proteins wurde aufgrund von SDS-PAGE und Gel filtration auf ca. 39 kDa geschätzt. N-terminale Aminosäurenanalyse und Westernblotuntersuchungen wurden benutzt, um das aus E. coli gereinigte humane pRb zu charakterisieren. Die Sekundär- und Tertiärstruktur wurden durch CD-Messungen und NMR-Spektroskopie überprüft. Die Präparation von pRB, über die hier berichtet wird, liefert ausreichende Mengen von diesem Protein für eine detaillierte funktionelle und strukturelle Charakterisierung des Reinoblasmaproteins. Das isotopen-gelabelte Protein kann benutzt werden, um die vorgeschlagenen pRb Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überprüfen, wie auch für Strukturbestimmung und “drug-design”. Das ungelabelte Protein kann benutzt werden, um Komplexe von pRb und seiner Partnerproteine zu machen. Das Lösen der Kristallstrukturen dieser Komplexe mag den Handlungsmechanismus des pRb in verschiedenen zellulären Prozessen erklären. Eine Anwendung dieser Arbeit ist die Untersuchung der Interaktion zwischen pRb und MyoD. MyoD gehört zu einer Gruppe von muskelspezifischen, helix-loop-helix Motif zeigende Transkriptionsfaktoren, welche essentiell für die Differenzierung von Muskelzellen in Vertebraten sind. Vorangegangene Studien zeigten daß MyoD mit der sog “small pocket domain” von pRb interagiert. Durch spezifische Binde-Essays und NMR Titrationen konnten wir mit unserer Arbeit zeigen, daß die “small pocket domain” des Retinoblastoma-proteins nicht mit MyoD in vitro interagiert, wie Vorangegangene Studien zeigten. Calpaine sind Cysteinproteasen, die in der calciumvermittelten Signaltransduktion, der Apoptose und degenerativen Krankheiten eine Rolle spielen. Calpaine sind wichtig für die Regulation des Zellzyklus, aber Regeln, die die Calpainspaltungsspezifität erklären, sind wenig verstanden. Diese Arbeit berichtet über in vitro Untersuchungen des Schemas der Calpain-Proteolyse des p19INK4d Proteins, einem cyclinabhängigen cdk4/6 Inhibitors, der den Zellzyklus von Säugern negativ reguliert. Die Daten, die hier vorgestellt werden, zeigen neue Eigenschaften der Calpain-Aktion: Calpaine schneiden p19INK4d unmittelbar nach stabilen α-helikalen Segmenten im Protein, aber nicht notwendigerweise bei Resten der Linkerpolypeptidsegmente, die am meisten dem Lösungsmittel zugänglich sind oder die hoch flexibel sind. Dies steht im Gegensatz zu Eigenschaften der Calpaine, die im Zusammenhang mit der Spezifität der Calpaine für ihre Substrate beobachtet wurden. Es wurde ebenfalls beobachtet, dass cdk6 nicht von Calpain geschnitten wird, was impliziert, dass Calpain in den Zellzyklus eingebunden sein kann, um den regulatorischen Proteinumsatz durch Cycline und cdk-Inhibitoren zu regeln.     «

Das Retinoblastoma Tumor Supressor Protein pRb ist ein Phosphoprotein des Zellkerns, das als negativer Regulator der zellulären Proliferation und Apoptose fungiert und ein Promoter der Zelldifferenzierung ist. Alle seine physiologischen Funktionen wurden aufgrund seiner Fähigkeit beschrieben, mit einem Großteil der zellulären und viralen Onkoproteine zu interagieren. Detaillierte strukturelle und funktionelle Analysen von pRb wurde dadurch erschwert, dass das saubere Protein fehlte. Diese Arbeit...     »