Die hier vorliegende Arbeit beschreibt strukturelle Untersuchungen an den Porinen Omp32 aus Comamonas acidovorans, P100 aus Thermus thermophilus sowie HVDAC1 und HVDAC2 aus Homo sapiens. In der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien und Mitochondrien existieren porenbildende integrale Proteine, die Porine, welche die Membran für die Translokation von Ionen und kleinen Molekülen permeabel machen. Gemessen an der Vielzahl funktioneller Messungen, die für diese Proteinklasse beschrieben wurden, fällt deren Interpretation durch den Mangel an strukturellen Daten immer noch schwer. Um diese Lücke teilweise zu schließen, werden in dieser Abhandlung drei strukturell noch weitgehend unbekannte Porine vorgestellt. Die Struktur des bakteriellen Porins Omp32 wurde durch Röntgenkristallografie über die SIRAS-Methode bei 2,1 Å gelöst. Das homotrimere Protein ist den bisher bekannten Porinen bezüglich ihrer Architektur sehr ähnlich, allerdings zeigt es hinsichtlich seiner Porengeometrie und Oberflächenladung neue Eigenschaften, die im Zusammenhang mit den funktionellen Aspekten neue Erklärungsansätze bieten. Die Struktur enthält ein in der Porenengstelle gebundenes Anion, das eine Funktion des Porins als Anionen-spezifischen Kanal für kleine organische Säuren nahelegt. Das Protein wurde im Komplex mit einem periplasmatischen Peptid kristallisiert, dessen Lokalisation und Sequenz eine Beteiligung an der Peptidoglykanbindung vermuten lässt. Damit ist in dieser Arbeit erstmals der strukturelle Nachweis für einen Porin-Peptid-Komplex gelungen. Protein P100 repräsentiert ein Porin aus einem thermophilen Bakterium, das drei neue strukturelle Merkmale zeigt: Neben einer ungewöhnlich großen integralen Membrandomäne, besitzt das homotrimere Protein einen langen triple-coiled-coil-Stil und eine SLH-Domäne, die als Peptidoglykan-Bindungsdomäne bekannt ist. P100 wurde mittels Elektonenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie und FTIR-Spektroskopie untersucht. Die elektronenmikroskopischen Daten negativ-kontrastierter 2D-Kristallen zeigen drei Symmetrie-verwandte Poren, die mit einem Durchmesser von 5 - 6 nm den der bisher strukturell bekannten Porine bei weitem übersteigt. Die drei Poren und die ca. 10 nm lange stilförmige Struktur der coiled-coil-Domäne ließen sich im Rasterkraftmikroskop getrennt voneinander durch Variation des Abstandes zwischen Spitze und Probe darstellen. Die Daten der FTIR-Spektroskopie bestätigen schließlich, dass es sich im Fall von P100 tatsächlich um ein Porin mit einem ungewöhnlich hohen a-helicalen Anteil handelt. Zwei humane Isoformen des mitochondrialen Porins wurden in E. coli kloniert und exprimiert. Das in Form ungefalteter inclusion bodies produzierte Protein konnte durch die Entwicklung eines effizienten Verfahrens in großen Mengen in seine native Form zurückgefaltet werden. Die Sekundärstrukturanteile der beiden rückgefalteten Isoformen wurden über FTIR-ATR-Messungen bestimmt. Die Struktur des Proteins wurde über Elektronenmikroskopie von in Eis eingebetteten 2D-Kristallen untersucht. Die Daten zeigen ein monomeres Barrelprotein mit den Dimensionen und der Sekundärstruktur eines bakteriellen Porins. Durch peptide mapping von HVDAC1 in Kombination mit MALDI-MS-Analysen der Fragmente wurde ein Topologiemodell des Porins entwickelt, das dieses als 16-strängiges Porin mit acht relativ langen Loop- und sieben kurzen Turnstrukturen vorschlägt.     «

Die hier vorliegende Arbeit beschreibt strukturelle Untersuchungen an den Porinen Omp32 aus Comamonas acidovorans, P100 aus Thermus thermophilus sowie HVDAC1 und HVDAC2 aus Homo sapiens. In der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien und Mitochondrien existieren porenbildende integrale Proteine, die Porine, welche die Membran für die Translokation von Ionen und kleinen Molekülen permeabel machen. Gemessen an der Vielzahl funktioneller Messungen, die für diese Proteinklasse beschrieben wurden, f...     »

The PhD thesis presented describes structural studies of porin Omp32 from Comamonas acidovorans, P100 from Thermus thermophilus and HVDAC1 and HVDAC2 from Homo sapiens. Porins are found in the outer membrane of Gram-negative bacteria and mitochondria. They are pore-forming integral membrane proteins that allow the diffusion of ions and small molecules. A variety of functional measurements describing the properties of this protein class exist but their interpretation is still complicated due to the lack of reasonable structural information. In order to fill this gap data of three structural unknown porins are presented. The structure of the bacterial porin Omp32 was solved at 2.1 Å by X-ray crystallography using the SIRAS method. The overall architecture of the homotrimeric protein is similar to all known proteins of this class but it shows remarkable differences concerning its pore geometry and surface potential. The data allow the development of new approaches to explain their functional properties based on structural data. The structure shows an anion bound to the pore constriction site that suggests the function of this porin as an anion-specific channel for organic acids. The protein was crystallized in complex with a small periplasmic protein that is supposed to be involved in peptidoglycane binding and it is therefore the first structural indication of such a protein-protein interaction is thereby presented. Protein P100 is a porin from a thermophilic bacterium that shows three new structural features which are: an unusual big membrane spanning part, a long triple coiled coil stork and a SLH domain supposed to be involved in peptidoglycane binding. P100 was studied using electron microscopy, atomic force microscopy and FTIR-spectrocopy. Electron micrographs of negatively stained 2D-crystals show three symmetry related pores of 5 - 6 nm in diameter much larger than the diameter known for structural known porins. The pore and the approx. 10 nm long coiled coil domain could be visualized under the atomic force microscope independently using forces image modes. FTIR data of P100 confirm the presence of a high a-helical content unusual for bacterial porins. Two human isoforms of the mitochondrial porin were cloned and expressed in E. coli. The protein was produced as inclusion bodies and highly efficient procedure for refolding of the protein was developed. The secondary structure content of the refolded samples was determined usind FTIR-ATR spectroscopy. The structure of the protein was analyzed using electron microscopy of ice embedded 2D crystals. The data show a monomeric barrel protein with dimensions and secondary structure similar two a bacterial protein. Peptide mapping of HVDAC1 in combination with MALDI-MS lead to the development of a topology model of the porin as a 16-stranded b-barrel protein with eight longer loops and seven small turns.     «

The PhD thesis presented describes structural studies of porin Omp32 from Comamonas acidovorans, P100 from Thermus thermophilus and HVDAC1 and HVDAC2 from Homo sapiens. Porins are found in the outer membrane of Gram-negative bacteria and mitochondria. They are pore-forming integral membrane proteins that allow the diffusion of ions and small molecules. A variety of functional measurements describing the properties of this protein class exist but their interpretation is still complicated due to t...     »