Zur Erforschung der molekularen Mechanismen der innaten Immunantwort im bovinen Euter werden vor allem primäre bovine Euterepithelzellen (pbMEC) verwendet. Da pbMEC die Alveolen des bovinen Euters auskleiden, stellen sie die erste zelluläre Abwehr gegen mögliche Pathogene dar und bilden somit die Blut-Euter-Schranke. In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass pbMEC Pathogene erkennen und spezifische Signaltransduktionswege induzieren können, die zur Produktion und Sekretion von chemotaktischen Molekülen führen. Es ist allerdings von großer Bedeutung abgewandelte Zellkulturmodelle, für die Erforschung zugrundeliegender molekular-physiologischer Mechanismen der innaten Immunantwort, zu etablieren. Dies könnte die Übertragbarkeit der Daten, die in einem in vitro Modell generiert wurden, erleichtern.
Unser Ziel war es ein funktionales 3D Zellkulturmodell der pbMEC zu generieren, welches versucht die Umgebung der pbMEC möglichst realitätsgetreu nachzuahmen. Hierfür wurden pbMEC aus der Milch von Brown Swiss Kühen isoliert und auf dem, die extrazelluläre Matrix nachahmendem Gerüst, Matrigel®, kultiviert. Den unterschiedlichen Zellkulturmedien-Kompositionen, wurden zudem noch die laktogenen Hormone Prolaktin und Hydrokortison und die essentielle Aminosäure L-Lysin zugesetzt. Basierend auf diesem funktionalen 3D Zellkultur Ansatz wurden zwei Infektionsstudien an isolierten pbMEC durchgeführt. Im Rahmen der ersten Studie sollten potentielle molekulare Biomarker gefunden werden, die eine Schlüsselrolle in der innaten Immunantwort gegen gram-positive Bakterien, einnehmen. Zudem sollten die molekularen Biomarker dazu beitragen, laktierende Kühe in „High Responder“ und „Low Responder“ zu unterteilen. Die Begriffe High und Low Responder definieren sich hierbei durch die Menge an spezifischem Immunglobulin A, das die Kuh durch eine vorangegangene Immunisierung produzieren und in die Milch abgeben kann. Im Rahmen dieser ersten Immunstudie wurde der gram-positive Erreger Clostridium difficile sowohl für die Immunisierung der Tiere als auch für die in vitro Immunstudien verwendet. Der gram-positive Erreger ist von großem Interesse für die Produktion von Immun-Milch, die zur Prävention von Clostridium difficile assoziierten Durchfallerkrankungen eingesetzt werden soll. Die zweite Studie befasste sich mit den Auswirkungen des Ketonkörpers Beta-Hydroxybutyrat (BHBA) auf die innate Immunantwort der pbMEC, welche mit dem gram-negativen Mastitis-Erreger Escherichia coli induziert wurden. Erhöhte BHBA Konzentrationen akkumulieren vor allem in der frühen Phase der Laktation und führen im Falle einer negativen Energiebilanz zur Entstehung der Stoffwechselerkrankung Ketose
Wir konnten erfolgreich ein 3D Zellkulturmodell von, aus frischer Milch isolierten, pbMEC etablieren und zeigen, dass pbMEC, die in 3D Zellkultur kultiviert wurden, einen polarisierten Phänotyp aufwiesen und dadurch in der Lage waren Alveolen-artige Strukturen in vitro zu bilden. Zudem resultierte die Kultivierung der pbMEC in 3D Zellkultur in einer verstärkten Produktion und Sekretion von Milch- und Molkenproteinen. Die Änderungen im Genexpressionsprofil von Genen, die für Milchproteine, aber auch für Komponenten des JAK-STAT und mTOR Signaltransduktionswegs kodierten, wurden zwischen pbMEC, die in 3D und 2D Zellkultur kultiviert wurden, verglichen. Die verbesserte Funktionalität der pbMEC in 3D Zellkultur, konnte durch RT-qPCR Experimente und LC-MS/MS Messungen nachgewiesen werden. In der ersten immunologischen Studie, die mit Hilfe des 3D Zellkulturmodells durchgeführt wurde, konnten durch ein RT-qPCR Verfahren (BioMarkTM HD 96x96, Fluidigm), 61 Expressionsprofile von ausgewählten Immungenen zwischen den High und Low Responder Tieren abgeglichen werden. Es konnte gezeigt werden, dass sich vor allem die pro-inflammatorischen Zytokine als potentielle molekulare Biomarker eignen. Im Rahmen der zweiten immunologischen Studie konnte mit Hilfe von RT-qPCR und ELISA Messungen ein immunsuppresiver Effekt durch die Co-Stimulation der pbMEC mit Escherichia coli und BHBA gezeigt werden.
Basierend auf diesen Ergebnissen konnte die erfolgreiche Entwicklung eines funktionalen 3D Zellkulturmodells der pbMEC beschrieben werden. Dieses 3D Zellkulturmodell, das die in vivo Situation der pbMEC besser repräsentiert, erscheint sehr vielversprechend für die zukünftige Generierung von vertrauensvollen und in vivo nahen Forschungsergebnissen.
«
Zur Erforschung der molekularen Mechanismen der innaten Immunantwort im bovinen Euter werden vor allem primäre bovine Euterepithelzellen (pbMEC) verwendet. Da pbMEC die Alveolen des bovinen Euters auskleiden, stellen sie die erste zelluläre Abwehr gegen mögliche Pathogene dar und bilden somit die Blut-Euter-Schranke. In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass pbMEC Pathogene erkennen und spezifische Signaltransduktionswege induzieren können, die zur Produktion und Sekretion von chemotaktisc...
»
Login
BibTeX