Die im Menschen stattfindende metabolische Aktivierung von Arylaminen ist ein komplexer Prozess, dessen toxikologischen Konsequenzen von vielen Variablen abhängen. Die Phase I- und II-Enzyme hCYP1A2 (humanes Cytochrom P450 1A2) und hNAT2 (humane N-Acetyltransferase2), deren ausgeprägter Polymorphismus die Symetrie und somit die aus der Interaktion beider Enzyme resultierende Toxizität beeinflussen kann, stellen Schlüsselenzyme in diesem Prozess dar. Eine isolierte Betrachtung nur eines dieser beiden Schlüsselenzyme würde folglich die realen Verhältnisse des Arylamin-Stoffwechsels nur sehr reduziert widerspiegeln. Mit der in der vorliegenden Arbeit durchgeführten stabilen Koexpression von hCYP1A2 und hNAT2*4, *5B, *6A und *13 in V79MZ Chinesischen Hamsterzellen werden sowohl das komplexe Zusammenspiel von Phase I und Phase II-Enzymen als auch der kaukasische hNAT2-Polymorphismus umfassend in vitro dargestellt. Die stabile Integration der cDNAs von hCYP1A2 und hNAT2*4, *5B, *6A und *13 ins V79MZ Genom und deren Expression wurde sowohl auf molekularbiologischer Ebene, als auch biokatalytisch eingehend charakterisiert. Unter Verwendung des pcDNA3.1(+)-Vektorsystems gelang es für hCYP1A2 und die polymorphen Formen der hNAT2 ein vergleichbares Expressionsniveau sicherzustellen. Die Verifikation der Substratspezifität rekombinanter hNAT2 aus V79MZ-Zellen bei Umsetzung des Markersubstrates Sulfamethazin gelang über einen Vergleich mit enzymkinetischen Parametern heterolog exprimerter hNAT1 und hNAT2 aus Baculovirus-transfizierten Insektenzellen. Um die Enzymaktivitäten der verschiedenen Allele des hNAT2-Gens miteinander vergleichen zu können, wurde ein standardisiertes, HPLC-UV basiertes Auswahlverfahren für hNAT2-Klone bezüglich der Umsetzung von 2-Aminofluoren zu N-Acetylaminofluoren entwickelt. Die Validität dieses Verfahrens konnte über einen Vergleich des Wildtyps hNAT2*4 mit der allelischen Variante hNAT*13 bestätigt werden, da diese Enzymvariante gemäss in vivo-Ergebnissen aufgrund ihrer gegenüber dem Wildtyp unveränderten Aktivität, als interne Kontrolle fungierte. Desweiteren lagen die für die N-Acetylierung von 2-Aminofluoren und Sulfamethazin ermittelten kinetischen Parameter im physiologischen Bereich und spiegeln damit die für die kaukasische Population typische bimordale Verteilung von langsamen und schnellen Acetylierer-Phänotypen wider. Darüber hinaus konnte in Übereinstimmung mit in vivo- und in vitro-Ergebnissen gezeigt werden, dass die Aminosäuren-Substitutionen Ile114Tyr, Lys268Arg und Arg197Gln mit einem Verlust an enzymatischer Aktivität verbunden sind, welche allerdings nicht auf Proteininstabilitäten sondern auf verringerte Substrataffinitäten zurückzuführen sind. Aufgrund der genotoxikologischen Untersuchungen ist für hNAT2 auf eine Schutzfunktion bei der Umsetzung des 2-Aminofluorens zu schliessen, da es in der Interaktion mit hCYP1A2 die Mutationsfrequenz deutlich senkt. Als Nebenbefund konnte für eine Reihe von unterschiedlich substituierten Aminophenolen gezeigt werden, dass deren Cytotoxizität von der relativen Ringposition ihrer Amino- und Hydroxylgruppe abhängig ist. Insgesamt gelang es also die V79 Cell BatteryTM formell um das Phase II-Enzym hNAT2 zu erweitern, enzymkinetische Unterschiede für die in der kaukasischen Population am häufigsten vorkommenden NAT2-Varianten in vitro zu verifizieren, sowie die toxikologische Relevanz der Interaktion von CYP1A2 und NAT2 zu demonstrieren. Aufgrund der Berücksichtigung mechanistischer und pharmakogenetischer Aspekte, könnte der Einsatz der nunmehr erweiterten V79 Cell BatteryTM, sowohl bei der Neuausrichtung der europäischen Chemikalienpolitk (REACH) als auch im Zusammenhang mit der präklinischen Arzneimittelentwicklung einen wichtigen Beitrag liefern.     «

Die im Menschen stattfindende metabolische Aktivierung von Arylaminen ist ein komplexer Prozess, dessen toxikologischen Konsequenzen von vielen Variablen abhängen. Die Phase I- und II-Enzyme hCYP1A2 (humanes Cytochrom P450 1A2) und hNAT2 (humane N-Acetyltransferase2), deren ausgeprägter Polymorphismus die Symetrie und somit die aus der Interaktion beider Enzyme resultierende Toxizität beeinflussen kann, stellen Schlüsselenzyme in diesem Prozess dar. Eine isolierte Betrachtung nur eines dieser be...     »

Metabolic activation of aromatic amines in humans is a complex process, whose toxicological consequences are dependent on many variable factors. The phase-1 and phase-2 enzymes hCYP1A2 (human Cytochrome P450 1A2) and hNAT2 (human N-Acetyltransferase 2), whose pronounced polymorphism can affect the symetry of this interaction, are both key enzymes and have a great impact on the subsequent toxicity. Because of this fact, the independent investigation of only one of these key enzymes would depict only an uncomplete picture of the arylamine metabolism. The stable coexpression of hCYP1A2 and hNAT2*4, *5B, *6A and *13 in V79MZ Chinese hamster cells represents a comprehensive approach on the one hand to depict the complex interaction of phase-1 and phase-2 enzymes and on the other hand reconstruct the caucasian hNAT2-polymorphism in vitro. The stable genomic integration of the cDNAs of hCYP1A2 and hNAT2*4, *5B, *6A and *13 and their expression could be demonstrated with molecularbiological and biocatalytical methods. Comparable expression levels of the recombinant cDNAs could be generated by using the pcDNA3.1(+)-vector system. Substrate specificity of recombinant hNAT2 could be verified by comparison with data of kinetic parameters of recombinant hNAT1 and hNAT2 from baculovirus transfected insect cells. In order to enable a comparison of enzyme activities of the hNAT2 allels, it was necessary to establish a standardized, HPLC-UV based selection method for active hNAT2 clones, with respect to their metabolism of 2-Aminofluorene. Validity of these process could be confirmed by using hNAT2*13 as an internal control and subsequent comparison with hNAT2*4, because no difference in enzymatic activity has been reported between these to alleles according to available literature. Kinetic parameters of N-Acetylation of 2-Aminofluoren and Sulfamethazine were found to be within the physiological range, thus the bimordal distribution of slow and rapid acetylator phenotypes within the caucasian population could be reflected. In compliance with in vitro and in vivo results, loss of enzymatic activity could be shown for aminoacid substitutions Ile114Tyr, Lys268Arg und Arg197Gln. It could be demonstrated, that the loss enzymatic activity is not due to less mRNA- and protein stability but to altered substrate affinities. Concerning the metabolism of 2-Aminofluoren a protective role of hNAT2 is suggested on the basis of genotoxicological approaches, wich have shown, that hNAT2 lowers mutation frequency while interacting whith hCYP1A2. Aside these observations, cytotoxicity of diverse aminophenols could be shown to be dependent from the relative ring position of amino and hydroxyl groups. Overall the V79 Cell BatteryTM could be extended by the implementation of the phase 2 enzyme hNAT2, differences enzyme kinetic parameters for the most common hNAT2 alleles of the caucasian population could be depicted in vitro and toxicological relevance could be demonstrated for the interaction of hCYP1A2 and hNAT2. Thus this work takes into account pharmacogenetic and mechanistic aspects, the extended V79 Cell BatteryTM might significantly contribute to the reform of European chemical policy as well as to preclinical drug development.     «

Metabolic activation of aromatic amines in humans is a complex process, whose toxicological consequences are dependent on many variable factors. The phase-1 and phase-2 enzymes hCYP1A2 (human Cytochrome P450 1A2) and hNAT2 (human N-Acetyltransferase 2), whose pronounced polymorphism can affect the symetry of this interaction, are both key enzymes and have a great impact on the subsequent toxicity. Because of this fact, the independent investigation of only one of these key enzymes would depict o...     »