One of the most important classes of membrane proteins are G-Protein-coupled-receptors (GPCRs). GPCRs represent a big part of the protein coding genome and are responsible for many biochemical processes, ranging from cancer to neurology. Due to their big role in physiology and pathophysiology, many drugs target GPCRs, to date approximately 1/3 of all FDA approved drugs. In order to understand these processes better and to develop drugs targeting those signaling pathways, it is from biggest importance to get a deeper understanding of the structure and dynamics of GPCRs and their corresponding G-proteins. In this work, I used evolutionary stabilized Neurotensin 1 Receptor (NTR1) variants with different signaling capacity as a model system for the investigating the dynamics and interactions of a GPCR by NMR spectroscopy. The reason for this choice is an easy and effective production of this GPCR in E. coli, which is needed for isotope labeling for nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy experiments. On the G-protein side, either the heterotrimeric G-protein extracted from insect cells or the alpha subunit (Gα) produced in E.coli was used. The key goal was to understand the effects of the dynamics of GPCRs and G-proteins on their interaction with each other. The first goal was to study the role of the nucleotide state of Gα on its structure and dynamics and therefor on its interaction with an activated GPCR. Thereby I showed that Gα in an apo state has the highest affinity to an activated GPCR as well as an open conformation enhancing GTP binding. In line with these findings, GTP-bound Gα shows no significant affinity to an activated GPCR with a tightly closed conformation. I used NMR experiments for the investigation of labeled Gα in this project. The second part of my work was focused on the GPCR side. Therefore, different labeling strategies like 13C methyl sulfide or selective isoleucine, leucine, valine and alanine (ILVA) labeling were used in order to facilitate NMR experiments to detect allosteric structural changes and dynamics during signaling. I could show that GPCR activation affects the whole GPCR with an allosteric mechanism, resulting in a helix 6 rearrangement on the cytosolic side. This is essential for the interaction of a GPCR with G-proteins. Furthermore, I could verify the importance of the ionic lock motif GPCR signaling. In summary, I was able to obtain a deeper understanding of the interaction between GPCRs and G-proteins, with a focus on each binding partner. Nonetheless, future experiments are required to further characterize GPCR plasticity and determine the allosteric structural changes that are required to transfer the signal induced by ligand binding through the membrane to activate a bound G-protein.      «

One of the most important classes of membrane proteins are G-Protein-coupled-receptors (GPCRs). GPCRs represent a big part of the protein coding genome and are responsible for many biochemical processes, ranging from cancer to neurology. Due to their big role in physiology and pathophysiology, many drugs target GPCRs, to date approximately 1/3 of all FDA approved drugs. In order to understand these processes better and to develop drugs targeting those signaling pathways, it is from biggest impor...     »

Eine der wichtigsten Klassen von Membranproteinen sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). GPCRs stellen einen großen Teil des Protein-kodierenden Genoms dar und sind für viele biochemische Prozesse verantwortlich, die von Krebs bis zur Neurologie reichen. Aufgrund ihrer großen Rolle in der Physiologie und Pathophysiologie zielen viele Medikamente auf GPCRs ab, bis heute etwa 1/3 aller von der FDA zugelassenen Medikamente. Um diese Prozesse besser zu verstehen und Medikamente zu entwickeln, die auf diese Signalwege abzielen, ist es von größter Bedeutung, ein tieferes Verständnis der Struktur und Dynamik von GPCRs und ihren entsprechenden G-Proteinen zu erlangen. In dieser Arbeit verwendete ich evolutionär stabilisierte Neurotensin-1-Rezeptor (NTR1) -Varianten mit unterschiedlicher Signalkapazität als Modellsystem für die Untersuchung der Dynamik und Wechselwirkungen eines GPCR mittels NMR-Spektroskopie. Der Grund für diese Wahl ist eine einfache und effektive Herstellung dieses GPCR in E. coli, die für die Isotopenmarkierung für Kernspinresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR) – Spektro-skopieexperimente benötigt wird. Auf der G-Protein-Seite wurde entweder das aus Insektenzellen extrahierte heterotrimere G-Protein oder die in E. coli hergestellte Alpha-Untereinheit (Gα) verwendet. Das Hauptziel war es, die Auswirkungen der Dynamik von GPCRs und G-Proteinen auf ihre Wechselwirkung miteinander zu verstehen. Das erste Ziel war es, die Rolle des Nukleotidzustands von Gα auf seine Struktur und Dynamik und damit auf seine Wechselwirkung mit einem aktivierten GPCR zu untersuchen. Dabei habe ich gezeigt, dass Gα in einem Apo-Zustand die höchste Affinität zu einem aktivierten GPCR sowie eine offene Konformation aufweist, die die GTP-Bindung verstärkt. In Übereinstimmung mit diesen Befunden zeigt GTP-gebundenes Gα keine signifikante Affinität zu einem aktivierten GPCR mit einer eng geschlossenen Konformation. Ich habe in diesem Projekt NMR-Experimente zur Untersuchung von markiertem Gα verwendet. Der zweite Teil meiner Arbeit konzentrierte sich auf die GPCR-Seite. Daher wurden verschiedene Markierungsstrategien wie 13C-Methylsulfid oder selektive Isoleucin-, Leucin-, Valin- und Alanin-Markierung (ILVA) verwendet, um NMR-Experimente zum Nachweis allosterischer Strukturänderungen und -dynamiken während der Signalübertragung zu erleichtern. Ich konnte zeigen, dass die GPCR-Aktivierung den gesamten GPCR mit einem allosterischen Mechanismus beeinflusst, was zu einer Helix-6-Umlagerung auf der zytosolischen Seite führt. Dies ist wesentlich für die Wechselwirkung eines GPCR mit G-Proteinen. Darüber hinaus konnte ich die Bedeutung des „ionic lock“ Motivs bestätigen für die GPCR-Signalübertragung. Zusammenfassend konnte ich ein tieferes Verständnis der Wechselwirkung zwischen GPCRs und G-Proteinen gewinnen, wobei ich mich auf jeden Bindungspartner konzentrierte. Dennoch sind zukünftige Experimente erforderlich, um die GPCR-Plastizität weiter zu charakterisieren und die allosterischen Strukturänderungen zu bestimmen, die erforderlich sind, um das durch Ligandenbindung induzierte Signal durch die Membran zu übertragen und ein gebundenes G-Protein zu aktivieren.      «

Eine der wichtigsten Klassen von Membranproteinen sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). GPCRs stellen einen großen Teil des Protein-kodierenden Genoms dar und sind für viele biochemische Prozesse verantwortlich, die von Krebs bis zur Neurologie reichen. Aufgrund ihrer großen Rolle in der Physiologie und Pathophysiologie zielen viele Medikamente auf GPCRs ab, bis heute etwa 1/3 aller von der FDA zugelassenen Medikamente. Um diese Prozesse besser zu verstehen und Medikamente zu entwickeln,...     »