Biosensors based on electro-switchable biosurfaces (ESB) can actively move analytical molecules attached to surface-grafted DNA nanolevers in a liquid environment and simultaneously report on the characteristics of this motion by observation of the emission of a fluorescent dye at the distal ends of the nanolevers. This makes ESB systems sensitive to any change of the hydrodynamic friction of the tested molecule, which is employed, for instance, to study interactions between protein molecules. Additionally, the absolute fluorescence emission of the dye can provide interaction parameters by use of fluorescence proximity sensing. This dissertation introduces novel applications of ESB biosensors that enable the detection of structural changes of proteins caused by post-translational modifications or thermally induced molecular transitions. For the tested proteins, both post-translational modifications and temperature dependent molecular changes show up as measurable changes in hydrodynamic friction. A second set of experiments examines the applicability of ESB biosensor systems to analyze DNA-related interactions. For this purpose, studies with a broad range of different interaction systems are performed, typically yielding association- and dissociation rate constants (kon and koff), as well as the equilibrium dissociation constant (KD). For two DNA-binding proteins, Smc5/6 and MutS, it is shown how the DNA interaction can depend on the state of the DNA (single-stranded or double-stranded) or on the presence of a single basepair mismatch. At the example of the zinc finger domain protein PRDM9 we demonstrate the feasibility of ESB biosensors to detect sequence-specific DNA binding in a complex sample solution (cell lysate). Furthermore, a detailed case study demonstrates the development of a modular sequence screening system to test the DNA affinity of a bacterial transcription factor. Finally, it is shown how fluorescence proximity sensing can be employed to characterize the sequence-specific DNA binding of small molecule polyamides.     «

Biosensors based on electro-switchable biosurfaces (ESB) can actively move analytical molecules attached to surface-grafted DNA nanolevers in a liquid environment and simultaneously report on the characteristics of this motion by observation of the emission of a fluorescent dye at the distal ends of the nanolevers. This makes ESB systems sensitive to any change of the hydrodynamic friction of the tested molecule, which is employed, for instance, to study interactions between protein molecules. A...     »

Biosensoren basierend auf elektrisch schaltbaren Biooberflächen (engl. electro-switchable biosurfaces; Abk. ESB) können aktiv Analytenmoleküle, die an oberflächenimmobilisierte DNA Nanohebel angefügt sind, in flüssiger Umgebung in Bewegung versetzen. Durch die zeitgleiche Beobachtung der Fluoreszenzemission von Fluorophoren an den oberen Enden der DNA Nanohebel können derartige Biosensoren die Bewegungscharakteristika der Nanohebel ausgeben. ESB Systeme sind daher sensitiv für Veränderungen der hydrodynamischen Reibung des Testmoleküls, was beispielsweise zur Untersuchung molekularer Interaktionen eingesetzt wird. Darüber hinaus lassen sich die Interaktionsparameter auch aus den Veränderungen der absoluten Fluoreszenzemissionen des Fluorophors ermitteln (fluorescence proximity sensing). Diese Dissertation stellt neue Anwendungen von ESB Biosensoren vor, die es ermöglichen strukturelle Veränderungen von Proteinen, bedingt durch posttranslationale Modifikationen oder durch thermisch induzierte molekulare Übergänge, zu detektieren. Bei den getesten Proteinen zeigen sich sowohl posttranslationale Modifikationen als auch temperaturabhängige Veränderungen als Änderungen der hydrodynamischen Reibung. In einem zweiten Satz an Experimenten wird die Anwendbarkeit von ESB Biosensorsystemen zur Analyse von DNA Interaktionssystemen untersucht. Hierzu wird ein breites Spektrum an Tests mit unterschiedlichen Interaktionssystemen durchgeführt und aus den erhaltenen Daten werden typischer Weise die jeweiligen Assoziationsratenkonstanten (kon) und Dissoziationsratenkonstanten (koff), sowie die Dissoziationskonstante im Gleichgewicht (KD) ermittelt. Anhand von zwei DNA bindenden Proteinen, Smc5/6 und MutS, wird gezeigt, wie die Interaktion mit DNA vom Zustand der DNA (einzelsträng oder doppelsträngig), bzw. vom Vorhandensein einer einzelnen nicht passenden Base abhängen kann. Am Beispiel des Zinkfingerproteins PRDM9 wird die Fähigkeit von ESB Biosensoren demonstriert sequenzspezifische DNA Bindung in einer komplexen Probenlösung (Zelllysat) zu detektieren. Darüber hinaus stellt eine detailierte Fallstudie die Entwicklung eines modularen Systems zum Vergleich der Affinität eines bakteriellen Transkriptionsfaktors zu verschiedenen DNA Sequenzen vor. Abschließend wird gezeigt, wie fluorscence proximity sensing eingesetzt werden kann, um das sequenzspezifische Binden DNA-bindender Polyamide zu charakterisieren.     «

Biosensoren basierend auf elektrisch schaltbaren Biooberflächen (engl. electro-switchable biosurfaces; Abk. ESB) können aktiv Analytenmoleküle, die an oberflächenimmobilisierte DNA Nanohebel angefügt sind, in flüssiger Umgebung in Bewegung versetzen. Durch die zeitgleiche Beobachtung der Fluoreszenzemission von Fluorophoren an den oberen Enden der DNA Nanohebel können derartige Biosensoren die Bewegungscharakteristika der Nanohebel ausgeben. ESB Systeme sind daher sensitiv für Veränderungen de...     »