The work presented in this thesis was carried out in the Department of Structural Research at the Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried, from July 2002 and December 2005. The first part of this thesis involved the understanding of e_ects of inhibitors on protein-protein interactions. Specifically, we studied the interactions in cellular proteins related to cancer or anticancer therapy. The NMR chemical shift perturbation methods have been successfully used for mapping binding interfaces in proteins and for screening small molecule lead compounds in ligand-protein interactions using 15N-labeled proteins. The screening studies for lead compounds concentrated so far on binary interactions of lead compounds with small to middle size domains of target proteins, but not on protein complexes. In order to study the effect of anatagonists on a protein complex, we devised a new methodology based on a dramatic difference in 1/T2 relaxation rates of the protein upon forming a large molecular weight complex. The size of one protein component should be small enough (less than ca. 15 kDa) to provide a good quality HSQC spectrum after 15N or 13C labeling of the protein. The size of the second component should be large enough so that the molecular weight of the preformed complex is larger than ca. 40 kDa. This method should provide an important extension to the traditional ”SAR by NMR” technique. The methodology was illustrated using the p53-MDM2 interaction. The oncoprotein MDM2 (human murine double minute clone 2 protein) inhibits the tumor suppressor protein p53 by binding to the p53 transactivation domain, and thus inhibiting the G1 cell cycle arrest and apoptosis. p53 deregulation has been observed to be very high in a variety of human tumors, except in cells that retain wild type p53. The disruption of the p53-MDM2 interaction with inhibitors has been shown to stabilize wild type p53 in cells and offers new therapeutics for cancer therapy. We have tested several small molecular weight compounds that were reported to inhibit this interaction. Only two of them from the totla 20 tested were found to be potent inhibitors of the p53-MDM2 binding. The interactions of cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) with p27 and CDK2-cyclin A2 with p27 have been tested using in vitro NMR experiments. The purine type of inhibitors of CDK2 were also studied with NMR spectroscopy. New insights were gained from these experiments into the involvement of CDKs and their cellular partners in controlling the cell cycle. The second major project involved functional investigations on the small pocket of the retinoblastoma protein (pRb) and its interaction with binding partners. The retinoblastoma tumor suppressor protein (pRb) is a key negative regulator of cell proliferation that is frequently deregulated in human cancer. More than 130 proteins have been reported to bind to pRb directly. Many of these interactions were reported with the pRb small pocket, which is the major focus of tumorigenic mutations in pRb. However, results found in the literature were ambiguous and contradictory. Many viral oncoproteins (for example, HPV E7, E1A) are known to bind to the pRb pocket domain via a LXCXE binding motif. There are also some 20 cellular proteins that contain a LXCXE motif and have been reported to associate with the pocket domain of pRb. Using the in-vitro methods including NMR spectroscopy, I have shown that LXCXE peptides of viral oncoproteins bind strongly to the pocket domain of pRb. Additionally, I showed that the LXCXE-like peptides of histone deacetylase 1 (HDAC1) binds to the same site on pRb, with however a weak (micromolar) and transient association. Systematic substitution of residues other than conserved L, C, and E show that the residues flanking the LXCXE are important for the binding. The interactions of pRb with the following proteins were also characterized using this approach: E2F1, HDAC1, HPV E7. In a structurally oriented project in this thesis we characterized the structure of staphostatin A from Staphylococcus aureus. Staphostatin A belongs to a new class of cysteine protease inhibitors.     «

The work presented in this thesis was carried out in the Department of Structural Research at the Max Planck Institute for Biochemistry, Martinsried, from July 2002 and December 2005. The first part of this thesis involved the understanding of e_ects of inhibitors on protein-protein interactions. Specifically, we studied the interactions in cellular proteins related to cancer or anticancer therapy. The NMR chemical shift perturbation methods have been successfully used for mapping binding interf...     »

Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung Strukturbiologie am Max- Planck-Institut für Biochemie in Martinsried zwischen Juli 2002 und Dezember 2005 angefertigt. Der erste Teil der Arbeit beinhaltet die Beschreibung der Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Im Speziellen wurden die Wechselwirkungen von zellulären Proteinen untersucht, die beim Krebs oder bei der Krebs Therapie eine Rolle spielen. Die NMR Methode der induzierten änderung der chemischen Verschiebung wurde erfolgreich eingesetzt, um die Bindungsstelle in Proteinen zu bestimmen und für ein Suchverfahren für kleine Moleküle in Ligand-Protein Wechselwirkung mit Hilfe von 15N-markierten Proteinen. Das NMR Suchverfahren für Schlüsselverbindungen beschränkte sich bis jetzt auf die binäre Interaktion der Schlüsselverbindung mit kleinen bis mittelgroßen Domänen von Zielproteinen. Proteinkomplexe wurden nicht untersucht. Um die Effekte von Antagonisten auf Proteinkomplexe zu testen, haben wir eine Methode entwickelt, die auf dem deutlichen Unterschied der 1/T2 Relaxationszeiten des Proteins, bei der Bildung von hochmolekularen Komplexen beruht. Die Größe der ersten Proteinkomponente sollte klein genug (kleiner 15 kDa) sein, um ein gutes HSQC-Spektrum nach 15N oder 13C Markierung der Proteine zu liefern. Die zweite Komponente sollte groß genug sein, damit der sich bildende Komplex eine Molekulargewicht von mehr als 40 kDa besitzt. Die Methode sollte eine wichtige Ergänzung zu der traditionellen “SAR by NMR” Technik darstellen. Die Methode wurde am p53-MDM2 Komplex getestet. Das Onkoprotein MDM2 (murine double minute clone 2 protein) inhibiert die Funktion des Tumor Supressor Proteins p53 in dem es an die Transaktivierungsdom äne von p53 bindet und damit, zum Einen die Arretierung in der G1 Phase des Zellzyklus, und zum Anderen die durch p53 vermittelte Apoptose unterbindet. Die Deregulation von MDM2 wurde in vielen Tumoren beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Zerstörung der p53- MDM2 Interaktion, in Tumoren die über funktionales Wildtyp p53 verfügen, mit Inhibitoren Wildtyp p53 in der Zelle stabilisiert und dieser Weg einen neuen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Krebs liefert. Wir haben eine Reihe von niedermolekularen Substanzen getestet, von denen eine Inhibierung der MDM2 p53 Wechselwirkung berichtet wurde. Nur zwei von zwanzig getesteten Substanzen konnten als potentielle Inhibitoren verifiziert werden. Die Interaktion der Cyclin-abhängigen Kinase 2 (CDK2) mit p27 und CDK2/Cyclin A2 mit p27 wurden in vitro mit NMR untersucht. Ebenso wurde Purine-Typ Inhibitoren für CDK2 mit NMR untersucht. Neue Erkenntnissen wurden aus diesen Experimenten gewonnen über die Rolle von CDK2 und dessen Bindungspartnern bei der Kontrolle des Zellzyklus. Der zweite Teil befasst sich mit der Untersuchung der kleinen Taschen Domäne des Retinoblastoma Proteins und dessen Bindungspartnern. Das Retinoblastoma Tumor Suppressor Protein (pRb) ist ein negativer Schlüsselregulator der Zellproliferation, der häufig in menschlichen Tumoren dereguliert ist. Von mehr als 130 Proteine wurde eine direkte Bindung an pRb nachgesagt. Viele dieser Wechselwirkungen sind mit der kleinen Pocket Domäne von pRb umfasst, in der bevorzugt Mutationen auftreten, die bei der Krebsentstehung beobachtet wurden. Viele virale Onkoproteine (wie z. B.: HPV E7, E1A) binden an die kleine Pocket Domäne von pRb über ihr LXCXE Bindungsmotiv. Es wurde ebenfalls von ca. 20 zelluliäre Proteine berichtet, die ein LXCXE Motiv haben, dass sie mit der kleinen Pocket Domäne von pRB assoziiert sind. Mit Hilfe der NMR Spektroskopie konnten wir zeigen, dass die LXCXE Peptide von viralen Onkoproteinen stark an die kleine Pocket Domäne von pRb binden. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass das LXCXE ähnliche Peptid der Histon Deacetylase 1 (HDAC1) an die gleiche Bindungsstelle an pRb bindet, jedoch mit einer schwächeren (im micromolaren Bereich) und transienten Bindung. Systematischer Ersatz von Aminosäureresten außer den konservierten Resten L, C und E zeigte, dass die flankierende Reste des LXCXE Motivs die Bindung an pRb wichtig für sind. Die Wechselwirkung von pRb mit den folgenden Proteinen wurde ebenfalls untersucht: E2F1, HDAC1, HPV E7. In einem mehr strukturell orientierten Projekt dieser Doktorarbeit haben wir die Struktur von Staphostatin A von Staphylococcus aureus untersucht. Staphostatin A gehört zu einer neuen Klasse von Cystein Protease Inhibitoren.     «

Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung Strukturbiologie am Max- Planck-Institut für Biochemie in Martinsried zwischen Juli 2002 und Dezember 2005 angefertigt. Der erste Teil der Arbeit beinhaltet die Beschreibung der Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Im Speziellen wurden die Wechselwirkungen von zellulären Proteinen untersucht, die beim Krebs oder bei der Krebs Therapie eine Rolle spielen. Die NMR Methode der induzierten änderung der chemischen Verschiebung wurde erfolgrei...     »