Although the G protein-coupled receptors (GPCRs) share a similar seven-transmembrane domain structure, only a limited number of amino acid residues is conserved in their protein sequences. One of the most highly conserved sequences is the NPxxY motif located at the cytosolic end of helix VII of those GPCRs that belong to the family of the rhodopsin/β-adrenergic-like receptors (Family A). The crystal structure of bovine rhodopsin indicates a hydrophobic interaction between Y7.53 of the NPxxY motif and F7.60 in the helix VIII; moreover, the hydroxyl group of Y7.53 is located close to N2.40 at the cytosolic end of helix II suggesting an interhelical hydrogen bond between helix VII and helix II (Palczewski et al., 2000). Because conservation of a sequence implies an important structural and/or functional role, this motif has been examined by mutagenesis studies in several GPCRs. Interestingly, these mutations affected receptor affinity, signalling, sequestration, and internalization of GPCRs to quite different extents, depending on the receptor under investigation. So far, no general theory could be elaborated that would explain all the observed results. The main purpose of the presented thesis was the investigation of the function of the highly conserved tyrosine (Y7.53) in the NPxxY motif of the human B2 bradykinin receptor (B2R) and its potential interaction partners. Similar to bovine rhodopsin, the B2R also a tyrosine amino acid residue (Y) at position 7.53, a phenylalanine (F) at position 7.60, but a glutamate (E) at position 2.40. The latter, however, is also able to form a hydrogen bond with the hydroxyl group of Y7.53. To study of E2.40↔Y7.53↔F7.60 loci we generated a series of receptor mutants and investigated them with regards to signalling, ligand-inducible phosphorylation, receptor internalization/ sequestration and localization as well as interaction with the Gq/11 protein and G protein-coupled receptor kinases. All experiments were done relatively to the wild-type (wt) receptor. Mutation of F7.60 in helix VIII of the B2R to alanine resulted in a mutant, termed F7.60A. This mutation did not much affect the affinity to its main ligand bradykinin (BK), ligand-inducible phosphorylation, internalization or signalling. In addition, mutant Y7.53F displayed also the properties of the B2R wt. As both point mutants Y7.53F and F7.60A resembled the wild-type phenotype, we assume that the interaction Y7.53↔F7.60could still compensate the absence of an interaction between Y7.53↔E2.40 and vice versa. Furthermore, exchange of Y7.53 to alanine resulted in a mutant, termed Y7.53A, in which both interactions (Y7.53↔F7.60 and Y7.53↔E2.40) were lost. This mutant internalized the ligand [3H]BK almost as rapidly as the B2R wt. However, receptor sequestration of the mutant after stimulation with BK was clearly reduced relatively the B2R wt. Confocal fluorescence microscopy revealed that, in contrast to the B2R, the Y7.53A was predominantly located intracellularly even in the absence of BK. Two-dimensional phosphopeptide analysis showed that the mutant Y7.53A constitutively exhibits a phosphorylation pattern similar to that of the BK-stimulated B2R wt. Ligand-independent Y7.53A internalization was demonstrated by the uptake of rhodamine-labelled antibodies directed to a tag sequence at the N-terminus of the mutated receptor. Co-immunoprecipitation revealed that Y7.53A is pre-coupled to Gq/11 without activating the G protein because the basal accumulation rate of inositol phosphate (IP) was unchanged as compared with B2R wt. We conclude, therefore, that the Y7.53A mutation of B2R induces a semi-active receptor conformation which is prone to ligand-independent phosphorylation and, as a consequence, also to internalization. The mutated receptor binds to, but does not activate, its cognate heterotrimeric G protein Gq/11, thereby limiting the extent of ligand-independent receptor internalization through steric hindrance. Whereas mutation of Y7.53 to phenylalanine (F) or F7.60 to alanine (A) did not much affect ligand-inducible phosphorylation and ligand internalization, the double mutant Y7.53F/F7.60A exhibited a dramatically reduced capability to internalization, most likely caused by the observed resistance to ligand-induced phosphorylation. Co-immunoprecipitation showed that Gq/11 protein was partially pre-coupled to the mutant receptor that probably led to inaccessibility of the mutated receptor for G protein-coupled receptor kinases (GRKs) and, consequently, failure of phosphorylation. However, signal transduction via the G protein Gq/11 was unaffected. The less conservative double mutant Y7.53A/F7.60A was also resistant to phosphorylation and lost its internalization capacity. Moreover, it also showed a strongly reduced IP signal. This double mutant inclined to interaction with GRKs in a ligand-independent manner. But, in contrast to mutant Y7.53A, GRKs phosphorylate the double mutant neither prior nor after stimulation with BK obviously staying bound to the receptor. This may cause the abolished signalling, as the cognate G protein – for sterical reasons – does not have excess to the receptor. To summarize, these data demonstrate that the highly conserved Y7.53 of the NPxxY motif and its potential partners F7.60 and E2.40 play an important role in the interaction of the B2R with the G protein Gq/11 and the GRKs. The binding to/activation of the specific G proteins or recognition by specific kinases requires presentation of a particular spatial distribution of the intracellular docking sites that are normally closed in the inactive state. Thus, our results suggest that the mutation of the Y7.53↔F7.60 locus interferes with a mechanism responsible for stabilizing the receptor in an inactive conformation. Thereby the receptor conformation may be altered and, consequently, the phenotype of the resulting mutants. Finally, it may be concluded that normal receptor activation most likely leads to the disruption of the Y7.53↔F7.60 interaction, too. This information will contribute to a better understanding of the activation mechanism of the B2R; in addition, these data will be very helpful in the creation of the high therapeutic potential B2 receptor agonists and antagonists.     «

Although the G protein-coupled receptors (GPCRs) share a similar seven-transmembrane domain structure, only a limited number of amino acid residues is conserved in their protein sequences. One of the most highly conserved sequences is the NPxxY motif located at the cytosolic end of helix VII of those GPCRs that belong to the family of the rhodopsin/β-adrenergic-like receptors (Family A). The crystal structure of bovine rhodopsin indicates a hydrophobic interaction between Y7.53 of the NPxxY moti...     »

Obwohl die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) eine gemeinsame Sieben-Transmembran-Domänenstruktur aufweisen, ist nur eine begrenzte Anzahl an Amino-säureresten in ihren Proteinsequenzen konserviert. Eine der am höchsten konservierten Sequenzen ist das NPxxY-Motiv, das sich am zytosolischen Ende der Helix VII befindet, vor allem bei den GPCRs, die zur Familie der Rhodopsin/beta-Adrenorezeptor-ähnlichen Rezeptoren (Familie A) gehören. Die Kristallstruktur des bovinen Rhodopsins legt eine hydrophobe Interaktion zwischen Y7.53 des NPxxY-Motivs und F7.60 in der Helix VIII nahe; außerdem befindet sich die Hydroxyl-gruppe von Y7.53 in der Nähe von N2.40 am zytosolischen Ende der Helix II, was auf eine interhelikale Wasserstoffbrücke zwischen Helix VII und Helix II hindeutet (Palczewski et al., 2000). Da die Konservierung einer Sequenz eine wichtige strukturelle und/oder funktionelle Rolle nahelegt, wurde dieses Motiv in Mutagenesestudien schon bei mehreren GPCRs untersucht. Diese Mutationen beeinflussten die Rezeptoraffinität, die Signaltransduktion und die Internalisierung der entsprechenden GPCRs, aber in ziemlich unterschiedlichem Ausmaß in Abhängigkeit von den untersuchten Rezeptoren. Bis jetzt konnte noch keine allgemeine Hypothese ausgearbeitet werden, die alle beobachteten Ergebnisse erklären würde. Die wichtigste Zielsetzung der vorgestellten Doktorarbeit war die Aufklärung der Funktion des hochkonservierten Tyrosins (Y7.53) im NPxxY-Motiv des humanen B2 Bradykinin-Rezeptors (B2R) und seiner möglichen Interaktionspartner. Ähnlich wie bovines Rhodopsin, hat auch der humane B2 Bradykinin-Rezeptor einen Tyrosinrest (Y) in Position 7.53, ein Phenylalanin (F) in Position 7.60, allerdings ein Glutamat (E) in Position 2.40. Letzteres kann aber ebenfalls eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hydroxylgruppe von Y7.53 bilden. Um die Interaktion der E2.40↔Y7.53↔F7.60 Loci aufzuklären, haben wir eine Reihe von Rezeptormutanten generiert und sie hinsichtlich der Signaltransduktion, der Liganden-induzierbaren Phosphorylierung, der Rezeptorinternalizierung/Sequestrierung sowie bezüglich der Interaktion mit Gq/11-Protein und G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) untersucht. Alle Experimente wurden im Vergleich zu Wildtyp(wt)-Rezeptor durchgeführt. Die Mutation von F7.60 in Helix VIII des B2R zu Alanin (=F7.60A) hatte keinen großen Einfluss auf die Affinität zu seinem Hauptliganden Bradykinin (BK), auf die Liganden-induzierbare Phosphorylierung, auf die Liganden-Internalisierung und auch nicht auf die Signaltransduktion. Auch die Mutante Y7.53F zeigte vergleichbare Eigenschaften wie der B2R wt. Da beide Punkt-Mutanten Y7.53F und F7.60A den Phänotyp des Wildtyps aufweisen, nehmen wir an, daß die noch vorhandene Interaktion Y7.53↔F7.60 die Abwesenheit einer Interaktion zwischen Y7.53↔E2.40 kompensieren kann und vice versa. Der Austausch von Y7.53 gegen Alanin (Y7.53A) ergab eine Mutante, in der beide Interaktionen (Y7.53↔F7.60 und Y7.53↔E2.40) verloren gingen. Diese Mutante internalisierte den Liganden [3H]BK fast genauso schnell wie B2Rwt. Die Rezeptorsequestrierung dieser Mutante nach Stimulation mit BK war jedoch deutlich reduziert im Vergleich zu B2R wt. Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie zeigte, daß im Gegensatz zu B2R die Mutante Y7.53A vorzugsweise intrazellulär lokalisiert war, sogar in Abwesenheit von BK. Die zweidimensionale Phosphopeptid-Analyse zeigte, daß die Mutante Y7.53A konstitutiv dasselbe Phosphorylierungsmuster aufwies wie der BK-stimulierte B2R wt. Eine Liganden-unabhängige Internalisierung von Y7.53A wurde durch die Aufnahme von Rhodamin-markiertem Antikörper – gerichtet gegen eine Peptidsequenz am N-terminus des mutierten Rezeptors gerichtet waren. Co-Immunopräzipitationsuntersuchungen belegten, daß Y7.53A an Gq/11 vorgekoppelt ist, ohne das G-Protein jedoch zu aktivieren, da die basale Akkumula-tionsrate für Inositolphosphate (IP) unverändert blieb im Vergleich zum B2R wt. Wir folgern daher, daß die Y7.53A-Mutation beim B2R eine semi-aktive Rezeptor-konformation erzeugt, die Liganden-unabhängig phosphoryliert wird und daher auch internalisiert. Der mutierte Rezeptor bindet an sein entsprechendes heterotrimeres G-Protein Gq/11, wodurch das Ausmass der Liganden-unabhängigen Internalisierung auf Grund einer sterischer Blockade verringert wird. Während die Mutation von Y7.53 zu Phenylalanin (F) oder von F7.60 zu Alanin (A) die Agonisten-induzierbare Phosphorylierung und Liganden-Internalisierung nicht wesentlich beeinflusste, zeigte die Doppelmutante Y7.53F/F.7.60A eine dramatisch reduzierte Fähigkeit zur Internalisierung, die sehr wahrscheinlich durch ihre fehlende Liganden-induzierte Phosphorylierbarkeit bedingt ist. Auch hier belegte Co-Immunopräzipitationsexperimente, daß das G-Protein Gq/11 bereits an den mutierten Rezeptor gebunden war, was wahrscheinlich zu einer Unzugänglichkeit des mutierten Rezeptors für GRKs führte, und als Folge davon in einer schlechten Phosphorylierbarkeit resultierte. Die Signaltransduktion über das G-Protein Gq/11 hingegen blieb unbeeinflusst. Die weniger konservartive Doppelmutante Y7.53A/F7.60A zeigte ebenfalls eine schlechte Phosphorylierbarkeit und hatte zudem die Fähigkeit zur Internalisierung verloren. Darüber hinaus war auch das IP-Signal deutlich reduziert. Diese Doppelmutante neigte dazu, mit GRKs auch ohne Stimulation durch einen Agonisten zu interagieren. Aber im Gegensatz zur Mutante Y7.53A phosphorylierten die GRKs die Doppelmutante weder vor noch nach der Stimulation mit Bradykinin, sondern blieben offensichtlich inaktiv an die Mutante gebunden. Dies führte wahrscheinlich zur Blockade der Signaltransduktion, da das entsprechende G-Protein aus sterischen Gründen keinen Zugang zum Rezeptor erhielt. Zusammengefaßt zeigen die Daten, daß das hoch konservierte Y7.53 im NPxxY-Motiv und seine potentiellen Partner F7.60 und E2.40 eine wichtige Rolle bei der Interaktion des B2R mit dem G-Protein Gq/11 und den GRKs spielen. Die Bindung an die entsprechenden spezifischen G-Proteine und ihre Aktivierung oder die Erkennung durch spezifische Rezeptor-Kinasen erfordert die Präsentation einer besonderen räumlichen Verteilung intrazellulärer Andockstellen, die normalerweise im inaktiven Zustand verborgen sind. Unsere Resultate lassen folglich vermuten, daß die Mutation des Y7.53↔F7.60-Locus mit einem Mechanismus interferiert, der für die Stabilisierung des Rezeptors im inaktiven Zustand verantwortlich ist. Mutationen in diesen Bereich führen offensichtlich zu einer Änderung der Rezeptor-konformation und demzufolge auch zu veränderten Phänotypen der resultierenden Mutanten. Es liegt nahe anzunehmen, daß eine normale Rezeptoraktivierung ebenfalls über eine Änderung der Interaktion Y7.53 ↔F7.60 läuft. Diese Information wird zu einem besseren Verständnis des B2R-Aktivierungsmechanismus beitragen. Zusätzlich sollten diese Datten sehr nützlich bei der Herstellung von hochwirksamen B2R Agonisten und Antagonisten sein.     «

Obwohl die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) eine gemeinsame Sieben-Transmembran-Domänenstruktur aufweisen, ist nur eine begrenzte Anzahl an Amino-säureresten in ihren Proteinsequenzen konserviert. Eine der am höchsten konservierten Sequenzen ist das NPxxY-Motiv, das sich am zytosolischen Ende der Helix VII befindet, vor allem bei den GPCRs, die zur Familie der Rhodopsin/beta-Adrenorezeptor-ähnlichen Rezeptoren (Familie A) gehören. Die Kristallstruktur des bovinen Rhodopsins legt eine hyd...     »