Diese Arbeit dokumentiert die Ergebnisse der Untersuchungen des bakteriellen Cytoskeletts von Spiroplasma melliferum, die durch Anwendung der Kryo-Elektronentomographie und biochemischer Methoden gewonnen wurden. Die Elektronentomographie ist eine Abbildungstechnik, die eine drei-dimensionale (3-D) Abbildung pleomorpher, biologischer Objekte, wie z.B. Zellen, Organellen, Viren oder Proteine, mit einer Auflösung von derzeit 4-6 Nanometern ermöglicht. Durch Kombination mit Kryo-Präparationsmethoden, d.h. der Einbettung der Probe in einen amorphen Eisfilm, kann das Objekt in einem quasi-nativen Zustand untersucht werden. Diese Technik eignet sich daher bestens, um die Struktur und räumliche Anordnung abbildbarer makromolekularer Aggregate eines Organismus aufzuklären. Ein limitierender Faktor für die Elektronentomographie ist die Größe des zu untersuchenden Objekts, welches eine Dicke von weniger als einem Mikrometer aufweisen sollte. Aus diesem Grund wurde für diese Arbeit das helikale Bakterium S. melliferum (Klasse Mollicutes) ausgewählt, welches einen Durchmesser von etwa 200 nm hat und nach bisherigen Untersuchungen ein Cytoskelett aufweisen soll. Um die Existenz dieses Cytoskeletts zu überprüfen und einen detaillierten Einblick in dessen Struktur, Funktionsweise und Zusammensetzung zu erhalten, wurden in dieser Arbeit Elektronentomogramme aufgenommen, computergestützte Bewegungsmodelle aufgestellt und biochemische Untersuchungen der Cytoskelett-Filamente durchgeführt. Die elektronentomographische Datenaufzeichnung ganzer Zellen erfolgte mit Hilfe eines 300 kV Transmissions-Elektronenmikroskops, welches mit einer Feldemissionskathode und einem Energiefilter ausgestattet ist. Der Energiefilter ermöglicht die Abtrennung inelastisch gestreuter Elektronen, die sich durch Kontrasterniedrigung negativ auf die Bildaufnahmen auswirken würden. Dennoch weisen die Tomogramme aufgrund der niedrigen Elektronendosis, die für vitrifizierte, biologische Proben unabdingbar ist, ein geringes Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf. In den aufgenommenen Tomogrammen konnte ein Cytoskelett nachgewiesen werden, welches aus drei Bändern aus parallel angeordneten Filamenten unterschiedlicher Dicke besteht. Zwischen zwei Bändern aus je fünf dicken (11 nm) Filamenten liegt ein Band aus neun dünnen (4 nm) Filamenten. Diese Filamentbänder erstrecken sich helikal, dicht unterhalb der Zellmembran, über die ganze Länge der Zelle. Durch Western-Blot-Analyse und Sequenzierung konnten desweiteren zwei Filament-bildende Proteine nachgewiesen werden, das sogenannte „Fibril“-Protein und das Aktin-ähnliche Protein MreB. Isolierungs- und Aufreinigungsversuche gelangen nur für das „Fibril“-Protein, für das elektronenmikroskopisch gezeigt werden konnte, daß es etwa 10 nm dicke Filamente bildet. Es wird angenommen, daß das Protein MreB die dünnen Filamente bildet, welche jedoch sehr instabil sind und daher bei der Isolierung zerfallen. Die aufgestellten Bewegungsmodelle ließen zudem eine Erklärung verschiedener Bewegungsmechanismen dieser schwimmenden Bakterien zu. Demnach ermöglichen Längen- oder Abstandsänderungen der beiden äuβeren Filamentbänder mittels des dazwischen liegenden Bandes eine Fortbewegung dieser Bakterien.     «

Diese Arbeit dokumentiert die Ergebnisse der Untersuchungen des bakteriellen Cytoskeletts von Spiroplasma melliferum, die durch Anwendung der Kryo-Elektronentomographie und biochemischer Methoden gewonnen wurden. Die Elektronentomographie ist eine Abbildungstechnik, die eine drei-dimensionale (3-D) Abbildung pleomorpher, biologischer Objekte, wie z.B. Zellen, Organellen, Viren oder Proteine, mit einer Auflösung von derzeit 4-6 Nanometern ermöglicht. Durch Kombination mit Kryo-Präparationsmethode...     »

This work documents the results of the investigations of the bacterial cytoskeleton of Spiroplasma melliferum, which have been obtained using cryo-electron tomography and biochemical methods.Electron tomography is an imaging technique that is presently capable of providing three-dimensional (3-D) images of pleomorphic, biological objects such as cells, organelles, viruses or proteins at a resolution of 4-6 nanometers. In combination with cryo-preparation techniques, which means embedding of the specimen in amorphous ice, the object can be investigated in a close-to-native state. Therefore, this technique is most suitable to reveal the structure and spatial arrangement of illustratable macromolecular aggregates of an organism. A limiting factor for electron tomography is the size of the investigated object, which should have a thickness of less than one micrometer. For this reason the helical bacterium S. melliferum (class Mollicutes), which has a diameter of about 200 nm and has a cytoskeleton according to previous investigations, was chosen for this work. Apart from the recording of electron tomograms, computer-based motility models were built up and biochemical investigations of the cytoskeletal filaments were performed in this work in order to examine the existence of this cytoskeleton and to get a detailed insight into its structure, function and composition. The electron tomographic data acquisition of whole cells was performed using a 300 kV transmission electron microscope, equipped with a field emission gun and an energy filter. The energy filter enables the separation of inelastically scattered electrons, which would have a negative effect on image acquisition due to contrast reduction. Nevertheless, the tomograms show a low signal-to-noise ratio due to the low electron dose, which is necessary for vitrified, biological specimen. In the acquired tomograms a cytoskeleton could be identified which comprises three ribbons of parallel filaments of different thickness. A ribbon of nine thin (4 nm) filaments is sandwiched between two ribbons of five thick (11 nm) filaments each. These ribbons run helically through the whole cell just underneath the cell membrane. Additionally, two filament-forming proteins, the so-called fibril protein and the actin-like protein MreB, could be identified using western blot and sequence analysis. Isolation and purification experiments only succeeded for the fibril protein, which was shown to build 10 nm wide filaments by electron microscopy. It is assumed that MreB forms the thin filaments, which, however, are very instable and therefore depolymerize during the isolation procedure. The proposed motility models explained different motility modes of these swimming bacteria. Thus, motility of these bacteria can be achieved by length or distance changes of the two outer ribbons via the ribbon lying in between.     «

This work documents the results of the investigations of the bacterial cytoskeleton of Spiroplasma melliferum, which have been obtained using cryo-electron tomography and biochemical methods.Electron tomography is an imaging technique that is presently capable of providing three-dimensional (3-D) images of pleomorphic, biological objects such as cells, organelles, viruses or proteins at a resolution of 4-6 nanometers. In combination with cryo-preparation techniques, which means embedding of the...     »