Das 26S Proteasom dient innerhalb des Ubiquitin-Proteasom-Systems als 2,5 MDa große Protease, die für den kontrollierten Abbau von Proteinen in der Zelle verantwortlich ist. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist für grundlegende zelluläre Funktionen von wesentlicher Bedeutung und nimmt eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von Krankheiten wie Krebs oder Alzheimer ein. Aus diesem Grund ist ein mechanistisches Verständnis dieser makromolekularen Maschine erforderlich. Strukturelle Informationen über das 26S Proteasom können einen Einblick in die zugrunde liegende Arbeitsweise des 26S Proteasoms gewähren. Über Jahrzehnte blieben aber Versuche erfolglos, das flexible 26S Proteasom für eine hochaufgelöste Röntgenstrukturanalyse zu kristallisieren. Um die dreidimensionale Struktur dieses Komplexes aufzuklären, wird in dieser Arbeit die Kryo-Elektronenmikroskopie zur Strukturanalyse herangezogen. Mit dieser Methode ist es möglich, isolierte und aufgereinigte Proteinkomplexe einer heterogenen Probe nativ in Eis eingebettet zu betrachten. Mit den digital aufgezeichneten zweidimensionalen Projektionen kann man dann mittels der Einzelpartikelanalyse eine dreidimensionale EM-Dichte bestimmen.
Das vorrangige Ziel dieser Arbeit war, eine hochaufgelöste dreidimensionale Struktur des menschlichen 26S Proteasom-Komplexes zu erhalten, um vor allem detaillierte Einblicke in den Aufbau des 19S Regulatorischen Partikels zu ermöglichen.
Als Grundlage für die Strukturbestimmung wurde zunächst ein Aufreinigungsprotokoll zur Gewinnung von aktiven 26S Proteasom-Molekülen aus humanen Erythrozyten etabliert. Die biochemische Charakterisierung mittels massenspektrometrischer Analyse zeigte, dass alle kanonischen Untereinheiten und keine bis wenige substöchiometrisch, transient bindende Proteine enthalten waren. Die Rekonstruktion der Einzelpartikel aus den elektronenmikroskopischen Daten ergab die Struktur des humanen 26S Proteasoms mit einer Auflösung von 6,8 Å. Das so bestimmte neue Strukturmodell des humanen 26S Proteasoms berichtigt ein bereits bestehendes Modell, dabei vor allem die Lage der Untereinheiten Rpn8, Rpn11 und Rpn12.
Durch Klassifikation und Varianzanalyse konnten zwei Bereiche mit hoher Flexibilität innerhalb des 19S Regulatorischen Partikels bestimmt werden. Die sehr hohe Beweglichkeit der Untereinheit Rpn1 steht vermutlich in Zusammenhang mit ihrer Funktion als Bindestelle für diverse transient bindende Proteine. Bekannt war dies bereits vom Hefe-Proteasom, doch beim humanen 26S Proteasom ist diese Flexibilität wesentlich größer. Völlig unbekannt war bisher die Flexibilität von Rpn6, die beim Homolog aus dem Hefe-Proteasom überhaupt nicht auftritt, aber schon in einer niedrigaufgelösten Struktur des 26S Proteasoms aus der Fruchtfliege zu vermuten war. Der Ursprung der beobachteten Rpn6-Flexibilität ist noch ungeklärt. Sie könnte zellspezifisch und damit natürlichen Ursprungs oder ein Artefakt der Aufreinigung sein. Zur endgültigen Aufklärung dieses Sachverhalts sind weitere Experimente und Untersuchungen erforderlich.
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Das 26S Proteasom dient innerhalb des Ubiquitin-Proteasom-Systems als 2,5 MDa große Protease, die für den kontrollierten Abbau von Proteinen in der Zelle verantwortlich ist. Das Ubiquitin-Proteasom-System ist für grundlegende zelluläre Funktionen von wesentlicher Bedeutung und nimmt eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von Krankheiten wie Krebs oder Alzheimer ein. Aus diesem Grund ist ein mechanistisches Verständnis dieser makromolekularen Maschine erforderlich. Strukturelle Informationen übe...
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