Motor ATPases use the energy of ATP hydrolysis to move nucleic acids or polypeptides. The phosphate-binding loop (P-loop) ATPase superfamily is by far the most abundant and diverse nucleotide-binding fold. All P-loop ATPases share a three-layered Rossman-fold and conserved Walker A and B motifs. The largest subfamily herein is the additional strand catalytic glutamate clade (ASCE), characterized by an additional strand in the central sheet and by a conserved catalytic glutamate, positioned C-terminally of the Walker B motif. In this work I used state-of-the-art cryo-EM single particle analysis (SPA) to investigate the structure and mechanism of two homohexameric ASCE ATPases: the archaeal DNA end-resection complex HerA-NurA and the molecular segregase p97. In archaea, the helicase-nuclease molecular machine HerA-NurA is responsible for processing the 5'-3' end of double-stranded (ds) DNA for repair by homologous recombination. Using cryo-EM single particle analysis I obtained a 7.3Å resolution structure of the HerA-NurA complex. We unambiguously fit the NurA crystal structure and a homology model of the HerA RecA-like ATPase in the cryo-EM density. HerA contains a central channel capable of accommodating up to three turns of dsDNA. This channel is aligned with the hydrophobic face of the NurA dimer, forming a continuous channel traversing the entire complex. Based on our structure, we proposed a model where the HerA motor threads a dsDNA substrate through its central channel towards the NurA nuclease for processing. The tight annulus of the NurA would act as a molecular ploughshare, splitting the dsDNA. This mechanism differs substantially from the end-resection mechanisms observed in the other kingdoms of life, revealing a novel mode of translocation-coupled DNA-end processing in archaea. The AAA+ ATPase p97 is a major facilitator of proteasomal degradation. In conjunction with the heterodimeric Npl4-Ufd co-factor, p97 extracts ubiquitylated proteins from their cellular environment. Previous attempts to study the conformational landscape of p97 by X-ray crystallography were hampered by crystal packing forces, with the N-terminal domains most strongly affected. Thus, I determined sub-nanometer cryo-EM structures of p97 in the presence of nucleotide analogs, allowing the study of nucleotide-dependent conformational changes. The structures revealed that p97 has six-fold symmetry in solution. In all structures, the pore formed by the D1 domains remains closed irrespective of the bound nucleotide, whereas the pore of the D2 domains shows an iris-like closing of its center upon binding ATP-γS. In addition, we observed nucleotide-dependent large-scale swinging motions of the N-terminal domains. This movement could provide the force necessary for the segregation activity of p97. The D2 cavity may contribute to additional enzymatic functions such as unfolding of bound client proteins. My work exemplifies the power of modern SPA. The HerA-NurA study shows that it is straightforward to use SPA to place individual crystal structures into their molecular context. Furthermore, our analysis of the p97 conformational cycle demonstrates that cryo-EM methods can provide important insights into the functional mechanisms of dynamic protein complexes. Thus, we expect that SPA will enhance our understanding of a wide variety of protein assemblies.     «

Motor ATPases use the energy of ATP hydrolysis to move nucleic acids or polypeptides. The phosphate-binding loop (P-loop) ATPase superfamily is by far the most abundant and diverse nucleotide-binding fold. All P-loop ATPases share a three-layered Rossman-fold and conserved Walker A and B motifs. The largest subfamily herein is the additional strand catalytic glutamate clade (ASCE), characterized by an additional strand in the central sheet and by a conserved catalytic glutamate, positioned C-ter...     »

ATP-abhängige molekulare Motoren hydrolysieren ATP, um Nukleinsäuren oder Proteine zu bewegen. Die am häufigsten vertretene und vielseitigste Familie dieser Enyzme ist die der „phosphate-binding loop“ (P-loop) ATPasen. Ihre Kennzeichen sind eine dreischichtige Rossman-Faltung und konservierte Walker A und B Motive. Die größte Unterfamilie der P-loop ATPasen stellt die „additional strand catalytic glutamate“ (ASCE) Gruppe, die sich durch einen weiteren Strang im zentralen β-Faltblatt und einen zusätzlich hoch konservierten Glutamatrest auszeichnet. In dieser Arbeit untersuche ich die Struktur homohexamerer ASCE-ATPasen im archaealen DNA-End-prozessierungs-Komplex HerA-NurA und der molekularen Segregase p97 mittels modernste Instrumentation der Kryo-Elektronenmikroskopie (EM) und Einzelpartikelanalyse. In Archaeen ist HerA-NurA als gekoppelter Helikase-Nuklease-Komplex für die Generierung einzelsträngiger DNA-Enden am 5´-3´-Ende eines DNA-Doppelstrangbruchs verantwortlich, wodurch die Reparatur durch homologe Rekombination ermöglicht wird. Mittels Einzelpartikelanalyse war es möglich, die Struktur des Enzymkomplexes bei einer Auflösung von 7.3 Å zu rekonstruieren. In das Volumen der erhaltenen Elektronendichte konnten wir sowohl die Kristallstruktur von NurA als auch ein auf verwandten Strukturen beruhendes Model großer Teile der HerA-Helikase eindeutig platzieren. NurA bindet mit seiner hydrophoben Seite auf die Oberfläche von HerA. Durch den gesamten Komplex zieht sich ein zentraler Kanal, der im Inneren von HerA bis zu drei Windungen doppelsträngige (ds)DNA aufnehmen kann. HerA arbeitet als Motor, der ein dsDNA-Substrat durch den zentralen Kanal in Richtung NurA schiebt. In NurA verengt sich der Kanal, was dazu führt, dass die dsDNA aufgeschmolzen wird. Ein derartiger Helikase-Nuklease-Mechanismus wurde bisher noch nicht beschrieben und unterscheidet sich stark von den Mechanismen vergleichbarer Enzyme in den unterschiedlichen Domänen des Lebens. Die ATPase p97 vom Typ AAA+ spielt eine wichtige Rolle für den proteasomalen Abbau von Proteinen. Zusammen mit dem dimeren Kofaktor Npl4-Ufd1 segregiert p97 ubiquitinierte Substrate von der zellulären Umgebung, um sie dem 26S-Proteasom zuzuführen. Bisherige Versuche, die dafür notwendigen Zustände von p97 mittels Röntgenkristallografie zu untersuchen, lieferten nur geringfügig unterschiedliche Strukturen, da die feste Kristallpackung die Bewegungen der einzelnen Domänen künstlich einschränkt. Mit Kryo-EM und Einzelpartikelanalyse dagegen kann man die verschiedenen Zustände von p97 untersuchen. Unter Verwendung verschiedener Nukleotid-Analoga gelang es mir so, sechsfach symmetrische Strukturen zu bestimmen, die bis in den Sub-Nanometerbereich aufgelöst sind. In diesen Rekonstruktionen ist die Pore der D1-ATPase-Domäne von p97 immer geschlossen, während sich die Pore der D2-ATPase-Domäne nach ATP-γS-Bindung verengt. Des weiteren zeigen die Strukturen ein Schwingen der N-terminalen Domäne, die damit als Hebel dienen könnte, um ubiquitylierte Proteine aus der zellulären Umgebung zu lösen. Die D2-Pore dient vermutlich anderen Zwecken, wie dem Entfalten bereits gebundener Proteine. Die vorliegende Arbeit zeigt Beispielhaft die vielfältigen Einsatzmöglichkeiten der Einzelpartikelanalyse mittels Kryo-EM. Im Falle von HerA-NurA ließ sich demonstrieren, dass atomare Modelle aus Kristallstrukturen in einen größeren molekularen Kontext eingefügt werden können. Zusätzlich zeigte die Studie von p97 das große Potenzial der eingesetzten Methode zur Untersuchung beweglicher Proteinkkomplexe in Lösung. Deshalb kann man davon ausgehen, dass für Struktur-Funktionsstudien komplexerer molekularer Maschinen, ähnlich denen in der vorliegenden Arbeit, die Einzelpartikelanalyse in Zukunft zunehmend an Bedeutung gewinnen wird.      «

ATP-abhängige molekulare Motoren hydrolysieren ATP, um Nukleinsäuren oder Proteine zu bewegen. Die am häufigsten vertretene und vielseitigste Familie dieser Enyzme ist die der „phosphate-binding loop“ (P-loop) ATPasen. Ihre Kennzeichen sind eine dreischichtige Rossman-Faltung und konservierte Walker A und B Motive. Die größte Unterfamilie der P-loop ATPasen stellt die „additional strand catalytic glutamate“ (ASCE) Gruppe, die sich durch einen weiteren Strang im zentralen β-Faltblatt und einen zu...     »