Die Strukturaufklärung von makromolekularen Komplexen und Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung ist eine große Herausforderung der Strukturbiologie. Hervorragend zur Lösung dieser Aufgabe geeignet ist die Kryoelektronentomographie (KET), die es ermöglicht, subzelluläre Strukturen direkt in ihrer zellulären Umgebung abzubilden. Durch die zusätzliche Anwendung von Subtomogrammalignierung und -mittelung können Elektronendichten von Proteinkomplexen mit deutlich erhöhten Signal-Rausch-Verhältnissen rekonstruiert werden. Die gegenwärtig erreichbare Auflösung hängt jedoch deutlich von der Genauigkeit ab, mit der die Kontrasttransferfunktion (Contrast transfer function, CTF) des Mikroskops und die Modulationstransferfunktion (Modulation transfer function, MTF) des Detektors bestimmt und anschließend korrigiert werden können. Das vorrangige Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer Methode zur Korrektur dieser Transferfunktionen mit hoher Genauigkeit, um die Auflösungsbegrenzung der KET in Kombination mit Subtomogrammalignierung zu umgehen. Zur Bestimmung und Korrektur der CTF wurde ein neuer Ansatz entwickelt, der auf einem erweiterten Bildaufnahmeschema basiert. Dabei werden mit hoher Elektronendosis zwei zusätzliche Bilder aufgenommen, die diametral entlang der Kippachse räumlich entfernt von der Aufnahmestelle des Objekts, um Strahlenschaden zu vermeiden, platziert werden. Durch die hohe Elektronendosis wird das Signal dieser Bilder verstärkt, so dass die CTF extrahiert und der Defokus genau bestimmt werden kann. Diese Defokuswerte werden schließlich zur Interpolation des Defokus an der Aufnahmestelle und zur CTF Korrektur verwendet. Zusätzlich wurde die Korrektur der MTF in den Prozess der Subtomogrammalignierung eingebunden. Diese neue Methode verhindert, auf der Ebene der Subtomogramme, eine zu hohe Verstärkung des Rauschanteils. Zur Validierung der Methode wurde das Porin MspA von Mycobacterium smegmatis eingesetzt. Durch die Anwendung von KET und Subtomogrammalignierung auf MspA, rekonstituiert in Lipidvesikel, war es möglich, eine dreidimensionale Rekonstruktion des Porins in einer nahezu natürlichen Umgebung zu erhalten. Trotz seiner geringen Molekülmasse von 160 kDa und dem geringem Kontrastunterschied zwischen Protein und Lipidmembran wurde eine Auflösung von etwa 12 Å (Fourier-shell correlation nach dem 0.5 Kriterium) erzielt.      «

Die Strukturaufklärung von makromolekularen Komplexen und Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung ist eine große Herausforderung der Strukturbiologie. Hervorragend zur Lösung dieser Aufgabe geeignet ist die Kryoelektronentomographie (KET), die es ermöglicht, subzelluläre Strukturen direkt in ihrer zellulären Umgebung abzubilden. Durch die zusätzliche Anwendung von Subtomogrammalignierung und -mittelung können Elektronendichten von Proteinkomplexen mit deutlich erhöhten Signal-Rausch-Verhä...     »

Elucidating the structure of macromolecular complexes and membrane proteins in their native environment is a major challenge of structural biology. Cryo-electron tomography (CET) is singular suited to solve this task with its potential to image sub-cellular structures directly in their cellular environment. Additionally, sub-tomogram alignment and averaging can be applied, resulting in electron density maps of protein complexes with intelligibly increased signal to noise ratios. However, the currently achievable resolution depends clearly on the accuracy with which the contrast transfer function (CTF) of the microscope and the modulation transfer function (MTF) of the detector can be determined and subsequently be corrected for. The major objective of this work was the development and validation of a method to correct for these transfer functions with high precision in order to overcome the resolution restriction of CET in combination with sub-tomogram alignment. For CTF determination and correction a new approach was developed, based on an extended image acquisition scheme. It adds to the acquisition protocol two high-dose electron micrographs, which are placed diametrically oriented along the tilt-axis spatially separated from the exposure position of the object, in order to avoid beam damage. The high electron dose used for these micrographs generates an increased signal, suitable for CTF extraction and accurate defocus determination. Finally these defocus values are used to interpolate the defocus at the exposure position and correct for the CTF. Additionally, MTF correction was integrated into the sub-tomogram alignment process. This novel procedure avoids the over-amplification of noise on the sub-tomogram level. For validation of the method the porin MspA of Mycobacterium smegmatis was chosen for analysis. By applying CET and sub-tomogram alignment to MspA, reconstituted in lipid vesicles, it was possible to obtain a three-dimensional reconstruction of this porin in its close-to-native environment. Despite its low molecular mass of 160 kDa and the minute contrast difference between protein and lipid membrane a resolution of approximately 12 Å (Fourier-shell correlation using the 0.5 criterion) was achieved.      «

Elucidating the structure of macromolecular complexes and membrane proteins in their native environment is a major challenge of structural biology. Cryo-electron tomography (CET) is singular suited to solve this task with its potential to image sub-cellular structures directly in their cellular environment. Additionally, sub-tomogram alignment and averaging can be applied, resulting in electron density maps of protein complexes with intelligibly increased signal to noise ratios. However, the...     »