Background: Hypoplastic left heart syndrome (HLHS) is a severe genetically heterogeneous congenital heart disease that encompasses several pathophysiologies. The genetic mechanism of HLHS is still unclear, and there is a lack of animal models to study the development of hypoplastic left heart structure。 Objective: The aim of this project is the comprehensive characterization of induced pluripotent stem cell (iPSC) lines derived from patients with HLHS and healthy controls and the production of highly enriched and pure cardiomyocytes (CMs). Methods: Before starting this thesis, iPSC lines were established from HLHS patients (n=3) and healthy controls (n=3) by integration-free transduction with Sendai virus. iPSC characterization included Sendai footprinting, the detection of endogenous pluripotency factor gene expression, and the capacity of iPSCs to differentiate were detected in cells of all three germlayers. A direct cardiac differentiation protocol with “small molecules” was applied to obtain high quality CMs. The iPSC-CMs were harvested on day 14 for analysis of gene expression, quality, and purity. Results: All iPSC lines were Sendai-virus free after 4 to 12 passages. Endogenous pluripotency factor expression could be detected in all iPSC lines, while expression of the reprogramming factor c-MYC was absent in two control lines. Direct cardiac differentiation showed the sensitivity of iPSC lines to CHIR99021 is quite variable. Furthermore, the initial cell seeding density could affect the efficiency of differentiation. The transcription factor TBX5 and its direct target gene NPPA were low expressed in the HLHS group, while expression of NKX2.5 was retarded until day 8 in the HLHS group but caught up by day 10. The expression of ISL1 and TNNT2 was similar in the two groups. iPSC-CMs started spontaneously beating between day 7 and 9. By day 14 more than 60% Trop T+ CMs could be detected in both the HLHS and control group. Conclusion: I have performed a complete characterization of six iPSC lines and determined defined and repeatable conditions for the production of iPSC-CMs of high quality and in large quantities. My results confirm that these iPSC lines are a powerful cellular system to study the molecular dysfunction of HLHS in vitro and the results confirm that iPSC-CMs can successfully be used in downstream applications such as the generation of engineered heart tissues.     «

Background: Hypoplastic left heart syndrome (HLHS) is a severe genetically heterogeneous congenital heart disease that encompasses several pathophysiologies. The genetic mechanism of HLHS is still unclear, and there is a lack of animal models to study the development of hypoplastic left heart structure。 Objective: The aim of this project is the comprehensive characterization of induced pluripotent stem cell (iPSC) lines derived from patients with HLHS and healthy controls and the production...     »

Hintergrund: Das Hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS) ist eine schwere, genetisch heterogene congenitale Herzerkrankung, die verschiedene Krankheitsbilder umfasst. Die genetischen Ursachen des HLHS sind noch immer unklar und es gibt keine Tiermodelle, um die Entwicklung hypoplastischer Linksherzstrukturen zu untersuchen. Zielsetzung: Das Ziel dieser Arbeit ist die umfassende Charakterisierung induzierter pluripotenter Stammzell-Linien (iPS Linien), die von Patienten mit HLHS oder gesunden Probanden etabliert wurden und die Generierung von hoch angereicherten, reinen Kardiomyozyten (KMs). Methoden: Vor Beginn dieser Doktorarbeit wurden iPS Linien von HLHS Patienten (n=3) und gesunden Probanden (n=3) durch integrationsfreie Transduktion mit Sendaiviren etabliert. Die Charakterisierung der iPS Linien umfasste ein Sendai footprinting, den Nachweis der endogenen Expression der Pluripotenzfaktoren und die Untersuchung der Fähigkeit der iPS Zellen, sich in Zellen aller drei Keimblätter zu entwickeln. Um KMs von hoher Qualität zu erhalten wurde ein direktes kardiales Differenzierungsprotokoll mit „small molecules“ verwendet. Am Tag 14 der Differenzierung wurde die Genexpression, die Qualität und die Reinheit der aus den iPS Zellen generierten KMs analysiert. Ergebnisse: Nach 4 bis 12 Passagen waren alle iPS Linien frei von Sendai-Virus. Die endogene Expression der Pluripotenzfaktoren konnte in allen iPS Linien nachgewiesen werden, während in zwei Kontroll iPS Linien keine Expression des Reprogrammierungsfaktors c-MYC gezeigt werden konnte. Bei der direkten kardialen Differenzierung war die Sensitivität der iPS Linien gegenüber CHIR99021 sehr variabel. Darüber hinaus hatte die ursprüngliche Dichte der Zellen beim Aussäen einen Effekt auf die Effizienz für Differenzierung. Während dieser wurden der Transkriptionsfaktor TBX5 und NPPA, ein direktes Zielgen, in der HLHS Gruppe in sehr geringem Ausmass exprimiert. Die Expression von NKX2.5 war bis Tag 8 in der HLHS Gruppe verzögert, pendelte sich aber am Tag 10 ein. Die Expression von ISL1 und TNNT2 war in beiden Gruppen sehr ähnlich. Aus iPS Zellen generierte KMs begannen spontan zwischen Tag 7 und 9 zu schlagen. An Tag 14 konnten sowohl in der HLHS als auch in der Kontroll-Gruppe über 60% Trop T+ Zellen detektiert werden. Schlussfolgerung: In der vorliegenden Arbeit habe ich bei sechs iPS Linien eine komplette Charakterisierung durchgeführt. Ich habe definierte und reproduzierbare Bedingungen bestimmt unter denen KMs in hoher Qualität und in grossen Mengen aus iPS Zellen generiert werden können. Meine Ergebnisse belegen, dass diese iPS Linien ein leistungsfähiges zelluläres System darstellen, um die molekularen Dysfunktionen des HLHS in vitro zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die aus iPS Zellen generierten KMs in Downstream-Anwendungen wie etwa der Generierung von engineered heart tissues verwendet werden können.     «

Hintergrund: Das Hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS) ist eine schwere, genetisch heterogene congenitale Herzerkrankung, die verschiedene Krankheitsbilder umfasst. Die genetischen Ursachen des HLHS sind noch immer unklar und es gibt keine Tiermodelle, um die Entwicklung hypoplastischer Linksherzstrukturen zu untersuchen. Zielsetzung: Das Ziel dieser Arbeit ist die umfassende Charakterisierung induzierter pluripotenter Stammzell-Linien (iPS Linien), die von Patienten mit HLHS oder gesunden P...     »