Übergeordnetes Ziel der Studien war es, die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB bei chronisch oder akut entzündlichen Prozessen wie z. B. Atherosklerose und Sepsis besser zu verstehen. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Regulation des NF-kappaB-Systems in monozytären Zellen mit Schwerpunkt auf der Charakterisierung der endogenen IKK-Komplexe. Der Effekt der proinflammatorischen Mediatoren TNF und LPS sowie des Phorbolesters PMA auf diese Komplexe wurde genauer untersucht und Experimente zum Aufbau der Komplexe durchgeführt. Darüber hinaus war die Wirkung von chlamydialem Hsp60, das möglicherweise bei der Atherogenese eine Rolle spielt, auf das NF-kappaB-System Teil der Untersuchungen. Zur Charakterisierung des IKK-Komplexes in monozytären Zellen wurden verschiedene potente Stimuli des NF-kappaB-Systems eingesetzt und die differentielle Aktivierung der endogenen IKK-Komplexe analysiert. THP-1-Zellen wurden mit LPS, einem Bestandteil der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien, inkubiert. Dies führte zu einer relativ langsamen Zunahme der IKK-Aktivität mit einem Maximum bei 30 min. Interessanterweise trat nach 75 min ein zweiter Gipfel in der Aktivitätskurve auf. Das Inhibitorprotein IkappaB-alpha wurde dabei über 60 min langsam abgebaut, war nach 60 min nicht mehr nachweisbar und trat nach 105 min wieder auf. Bemerkenswert ist der deutlich spätere Abbau von IkappaB-epsilon. Im Gegensatz dazu hatte die Stimulation mit dem proinflammatorischen Zytokin TNF einen erheblich rascheren Anstieg der IKK-Aktivität und einen ebenso raschen Abbau von IkappaB-alpha und IkappaB-epsilon zur Folge. In Versuchsansätzen mit dem Phorbolester PMA wurde der IKK-Komplex nach 10 min deutlich aktiviert gefolgt von der Proteolyse des Inhibitorproteins IkappaB-alpha. Interessanterweise war hierbei keine Proteolyse von IkappaB-epsilon detektierbar. Die Aktivierung des IKK-Komplexes unterschied sich also abhängig von der Art des Stimulus in ihrer Intensität und im Zeitverlauf. In weiteren Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass in monozytären Zellen neben dem „klassischen“ IKK-Komplex aus IKK-alpha, IKK-beta und IKK-gamma endogene Komplexe auftreten, die IKK-beta und IKK-gamma, aber nicht IKK-alpha enthalten. Diese waren durch LPS aktivierbar. Die Annahme mehrerer Signalwege, die über unterschiedliche IKK-Subkomplexe eine differentielle Aktivierung des NF-kappaB-Systems ermöglichen, scheint demnach plausibel. Es wurde gezeigt, dass die Kinase NIK als Bestandteil des IKK-Komplexes vorkommt und durch überwiegend hydrophobe Wechselwirkungen an den Komplex gebunden ist. NIK-enthaltende Komplexe waren durch TNF und LPS aktivierbar. Darüber hinaus wurden Experimente zur Wirkung des Hsp60 von Chlamydia pneumoniae auf das NF-kappaB-System durchgeführt. Nach Behandlung monozytärer Zellen mit Hsp60 zeigte sich eine deutlich erhöhte Aktivität der IKK-Komplexe sowie ein Anstieg von aktiviertem NF-kappaB. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit der Annahme, dass chlamydiales Hsp60 bei der Pathogenese der Atherosklerose eine Rolle spielen könnte. Die vorgestellten Untersuchungen ermöglichen ein besseres Verständnis des Aufbaus und der Funktion des IKK-Komplexes. Die Existenz von funktionell aktiven Subkomplexen und die Möglichkeit, diese gezielt zu beeinflussen, könnte einen Angriffspunkt für selektive diagnostische und therapeutische Strategien darstellen.      «

Übergeordnetes Ziel der Studien war es, die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB bei chronisch oder akut entzündlichen Prozessen wie z. B. Atherosklerose und Sepsis besser zu verstehen. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Regulation des NF-kappaB-Systems in monozytären Zellen mit Schwerpunkt auf der Charakterisierung der endogenen IKK-Komplexe. Der Effekt der proinflammatorischen Mediatoren TNF und LPS sowie des Phorbolesters PMA auf diese Komplexe wurde genauer untersucht und Expe...     »

It was the aim of the present studies to better understand the role of the transcription factor NF-kappaB in chronic and acute inflammatory processes, e.g. atherosclerosis and sepsis. The present paper deals with the characerisation of endogenous IKK complexes. The effect of the proinflammatory mediators TNF, LPS and PMA on these complexes was investigated. In addition, the impact of chlamydial hsp60 (which may be involved in atherogenesis) on the NF-kappaB system was part of the present studies. Differential activation patterns for these stimuli were shown. Stimulation of THP-1 cells with LPS led to a relatively slow increase in IKK activity with a maximum at 30 min. Interestingely, there was a second peak of activation after 75 min. Parallel to this, the inhibitory protein IkappaB-alpha was slowly degraded and was not detectable any more after 60 min. After 105 min it reappeared. Remarkabely, IkappaB-epsilon degradation occured significantly later. In contrast, stimulation with the cytokine TNF was associated with a much faster increase of IKK activity and a similarly fast degradation of IkappaB-alpha and -epsilon. Noteworthy, there was no detectable degradation of IkappaB-epsilon after stimulation with PMA. Hence, the there obviously are different activation patterns of the IKK complex regarding intensity as well as time response. In further studies endogenous complexes were detected that were composed of IKK-beta and -gamma, but did not contain IKK-alpha, in contrast to the "canonical" complexes that are assembled of IKK-alpha, -beta and -gamma. The IKK-alpha deficient complexes were activated by incubation with LPS. The existence of different cascades leading to NF-kappaB activation via regulation of different IKK complexes seems plausible. Complexes containing the kinase NIK were activated by TNF and LPS. NIK was shown to be a associated to IKK complexes via hydrophobic bonds. Furthermore, the effect of chlamydial hsp60 on the NF-kappaB system was investigated. Following incubation with hsp60, a significant activation of IKK complexes in monocytic cells occured as well as an increase in NF-kappaB activity. These findings concur with the hypothesis that chlamydial hsp60 might play a role in the pathogenesis of atherosclerosis. The presented data support the understanding of structure and function of the IKK complex. Different, functionally active, subcomplexes might disclose selective diagnostic and therapeutic possiblities.      «

It was the aim of the present studies to better understand the role of the transcription factor NF-kappaB in chronic and acute inflammatory processes, e.g. atherosclerosis and sepsis. The present paper deals with the characerisation of endogenous IKK complexes. The effect of the proinflammatory mediators TNF, LPS and PMA on these complexes was investigated. In addition, the impact of chlamydial hsp60 (which may be involved in atherogenesis) on the NF-kappaB system was part of the present studies...     »