Hintergrund:
Das Hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS) ist eine schwere, genetisch heterogene congenitale Herzerkrankung, die verschiedene Krankheitsbilder umfasst. Die genetischen Ursachen des HLHS sind noch immer unklar und es gibt keine Tiermodelle, um die Entwicklung hypoplastischer Linksherzstrukturen zu untersuchen.
Zielsetzung:
Das Ziel dieser Arbeit ist die umfassende Charakterisierung induzierter pluripotenter Stammzell-Linien (iPS Linien), die von Patienten mit HLHS oder gesunden Probanden etabliert wurden und die Generierung von hoch angereicherten, reinen Kardiomyozyten (KMs).
Methoden:
Vor Beginn dieser Doktorarbeit wurden iPS Linien von HLHS Patienten (n=3) und gesunden Probanden (n=3) durch integrationsfreie Transduktion mit Sendaiviren etabliert. Die Charakterisierung der iPS Linien umfasste ein Sendai footprinting, den Nachweis der endogenen Expression der Pluripotenzfaktoren und die Untersuchung der Fähigkeit der iPS Zellen, sich in Zellen aller drei Keimblätter zu entwickeln. Um KMs von hoher Qualität zu erhalten wurde ein direktes kardiales Differenzierungsprotokoll mit „small molecules“ verwendet. Am Tag 14 der Differenzierung wurde die Genexpression, die Qualität und die Reinheit der aus den iPS Zellen generierten KMs analysiert.
Ergebnisse:
Nach 4 bis 12 Passagen waren alle iPS Linien frei von Sendai-Virus. Die endogene Expression der Pluripotenzfaktoren konnte in allen iPS Linien nachgewiesen werden, während in zwei Kontroll iPS Linien keine Expression des Reprogrammierungsfaktors c-MYC gezeigt werden konnte. Bei der direkten kardialen Differenzierung war die Sensitivität der iPS Linien gegenüber CHIR99021 sehr variabel. Darüber hinaus hatte die ursprüngliche Dichte der Zellen beim Aussäen einen Effekt auf die Effizienz für Differenzierung. Während dieser wurden der Transkriptionsfaktor TBX5 und NPPA, ein direktes Zielgen, in der HLHS Gruppe in sehr geringem Ausmass exprimiert. Die Expression von NKX2.5 war bis Tag 8 in der HLHS Gruppe verzögert, pendelte sich aber am Tag 10 ein. Die Expression von ISL1 und TNNT2 war in beiden Gruppen sehr ähnlich. Aus iPS Zellen generierte KMs begannen spontan zwischen Tag 7 und 9 zu schlagen. An Tag 14 konnten sowohl in der HLHS als auch in der Kontroll-Gruppe über 60% Trop T+ Zellen detektiert werden.
Schlussfolgerung:
In der vorliegenden Arbeit habe ich bei sechs iPS Linien eine komplette Charakterisierung durchgeführt. Ich habe definierte und reproduzierbare Bedingungen bestimmt unter denen KMs in hoher Qualität und in grossen Mengen aus iPS Zellen generiert werden können. Meine Ergebnisse belegen, dass diese iPS Linien ein leistungsfähiges zelluläres System darstellen, um die molekularen Dysfunktionen des HLHS in vitro zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen auch, dass die aus iPS Zellen generierten KMs in Downstream-Anwendungen wie etwa der Generierung von engineered heart tissues verwendet werden können.
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Hintergrund:
Das Hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS) ist eine schwere, genetisch heterogene congenitale Herzerkrankung, die verschiedene Krankheitsbilder umfasst. Die genetischen Ursachen des HLHS sind noch immer unklar und es gibt keine Tiermodelle, um die Entwicklung hypoplastischer Linksherzstrukturen zu untersuchen.
Zielsetzung:
Das Ziel dieser Arbeit ist die umfassende Charakterisierung induzierter pluripotenter Stammzell-Linien (iPS Linien), die von Patienten mit HLHS oder gesunden P...
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