Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das zur Charakterisierung von Bodenmikroorganismen bereits etablierte Methodenspektrum der Bestimmung von Phospholipidfettsäuren (PLFA) so erweitert, daß auf Basis von Phospholipid-Etherlipiden (PLEL) nun auch Organismen der Domäne Archaea erfaßt werden können. Die Bestimmung der Phospholipid-Etherlipide basiert auf der Erfassung der ethergebundenen Seitenketten. Dabei wird nach Abspaltung der polaren Gruppe des Phospholipid-Moleküls das Kernlipid erhalten, aus dem durch Etherspaltung mit Jodwasserstoffsäure Alkyljodide freigesetzt werden, die in einer zweiten Reaktion, der sogenannten reduktiven Dehalogenierung (Zn in Eisessig), zu Kohlenwasserstoffe reagieren und somit geeignete Derivate für die GC/MS-Analyse darstellen. Durch verschiedene methodische Anpassungen ist es nun möglich, die ganze Bandbreite von ethergebundenen Isoprenoiden mit den Kettenlängen C15 bis C40 in Bodenextrakten sowohl qualitativ als auch quantitativ, zu bestimmen. So wurde in einer Auswahl von acht gefriergetrockneten Archaeenstämmen unter Verwendung zweier verschiedener Lipidextraktionsprotokolle eine durchschnittliche PLEL-Konzentration ermittelt, die mit der von Nichols et al. (1987) in 25 verschiedenen Archaeen bestimmten Durchschnittskonzentration vergleichbar ist. Ebenso konnte exemplarisch an einer Auswahl von Archaeen und Bakterien die von vielen Autoren beschriebene Bedeutung der PLEL für die Systematik der Prokaryoten mittels Hauptkomponentenanalyse von PLEL-Profilen bestätigt werden. Auch basierend auf PLFA-Profilen zeigte sich eine taxonomische Differenzierung von Archaeenpopulationen, die sich in weitgehender Übereinstimmung mit phylogenetischen Untersuchungen befand. So ergab die erweiterte Phospholipid-Analytik (PLFA+PLEL), daß die untersuchten Archaeen neben den ethergebundenen Isoprenoiden in ihren Membranlipiden auch signifikante Konzentrationen von nicht-estergebundenen Fettsäuren (NEL-PLFA) aufwiesen. In der Phospholipidfraktion von Bodenextrakten wurden neben den ethergebundenen Isoprenoiden auch unverzweigte und einfach-verzweigte Kohlenwasserstoffe mit Kettenlängen von C14 bis C35 in der von detektiert, die mittels Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie z.T. auf Etherlipide zurückgeführt werden konnten, wie sie in thermophilen Bakterien der Gattungen Thermotoga und Aquifex vorliegen. Bei der Anwendung der erweiterten Phospholipid-Methodik ging es darum, den Einfluß der Wiedervernässung auf Bodenmikroorganismen bei der Rekultivierung eines degradierten Niedermoor-Standorts (Donaumoos) zu untersuchen. Dazu fanden Bodenbeprobungen von oxisch und anoxisch geprägten Moorökosystemen zu vier jahreszeitlich unterschiedlichen Terminen auf dem Versuchsstandort Donaumoos zeitgleich mit den Methangasmessungen statt. Es handelte sich bei den beprobten anoxischen Bodenökosystemen um zwei Flächen, die seit Sommer 1998 mit nährstoffbelastetem Wasser aus Entwässerungsgräben beschickt und zu dieser Zeit auch mit Rohrkolben (Typha spp.) bepflanzt wurden. Als Referenzfläche diente eine nicht-vernäßte Grünlandparzelle, mit weitgehend oxischen Eigenschaften. Die Phospholipid-Untersuchungen der drei Parzellen ergaben, daß Archaea wesentlich zur mikrobiellen Biomasse in den beprobten Moorökosystemen beitrugen. Dabei traten Crenarchaeota vermehrt in der oxisch geprägten Referenzfläche und Euryarchaeota vermehrt in den wiedervernäßten, anoxischen Horizonten der Becken 1 und 2 auf. Ein Methodenvergleich zeigte, daß Phospholipid-Biomarker weitgehend zu denselben Aussagen führten wie molekulargenetische Methoden, basierend auf in situ-Hybridisierung (FISH) und DAPI-Färbung. Die Hauptkomponentenanalyse von Gesamtphospholipid-Profilen (PLFA+PLEL) ergab, daß sowohl Probenahmezeitpunkt (= Jahreszeit), als auch Oxie/Anoxie zu strukturellen Veränderungen in den Gesamtpopulationen führten. Ferner deuten die Lipid-Profile daraufhin, daß sich die mikrobiellen Populationen in den beiden überstauten Becken nach 1 Jahr Wiedervernässung noch in der Sukzessionsphase befanden. Während die Referenzfläche im Mittel der vier Beprobungen Methan aufnahm, emittierten die beiden anoxisch geprägten, wiedervernäßten Parzellen Methan, wobei die signifikant höchsten Werte im Becken 2 festgestellt wurden. Die Unterschiede in den Methanflußraten zwischen den drei Flächen lassen sich dadurch erklären, daß die Euryarchaeota-Populationen in den beiden überstauten Becken ausgeprägten bis stark ausgeprägten methanogenen Charakter zeigten. Dabei wurden tendenziell größere Euryarchaeota-Populationen in den Proben aus Becken 2 als in Becken 1 festgestellt. Außerdem wiesen die Proben der Referenzfläche größere Populationen an methanotrophen (= methanabbauenden) Bakterien auf, die zudem anders zusammengesetzt waren als in den Proben der anoxisch geprägten Bodenhorizonte, wobei in Becken 1 eine tendenziell größere Methanotrophenpopulation als in Becken 2 festgestellt wurde.     «

Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das zur Charakterisierung von Bodenmikroorganismen bereits etablierte Methodenspektrum der Bestimmung von Phospholipidfettsäuren (PLFA) so erweitert, daß auf Basis von Phospholipid-Etherlipiden (PLEL) nun auch Organismen der Domäne Archaea erfaßt werden können. Die Bestimmung der Phospholipid-Etherlipide basiert auf der Erfassung der ethergebundenen Seitenketten. Dabei wird nach Abspaltung der polaren Gruppe des Phospholipid-Moleküls das Kernlipid erhalten...     »

During methodological development, phospolipid fatty acid (PLFA) analysis, already established in microbial ecology, was extended by estimating phospholipid etherlipids (PLEL) characteristic of archaeal microorganisms. Phospholipid etherlipid analysis is based on the estimation of ether-linked side chains. Therefore, the polar head group of the phospholipid molecule is removed to access the ether core lipid, releasing alkyl iodides after cleavage of the ether bonds with HI acid. During the subsequent reductive dehalogenation step (Zn in acetic acid), these alkyl iodides are transformed to their corresponding hydrocarbons considered to be the most appropriate derivatives for gas chromatography/mass spectrometry analysis. Following several methodolgical adaptations, it is now possible to estimate both qualitatively and quantitatively the entire range of ether-linked isoprenoids with chains varying from C15 to C40 in soil extracts. Using eight selected freeze-dried archaeal monocultures, a mean PLEL concentration was estimated comparable to the average PLEL concentration estimated in 25 archaeal strains by Nichols et al. (1987). Furthermore, when lipid data was subjected to principal component analysis the significance of PLEL for prokaryotic systematics could be demonstrated in a selection of archaeal and bacterial monocultures. A discrimination of archaeal populations could be also performed based on PLFA profiles and which was in overall accordance with phylogenetic analyses. As revealed by extended phospholipid analysis (PLFA+PLEL), Archaea contained, apart from ether-linked isoprenoids, significant amounts of non-esterlinked fatty acids (NEL-PLFA) in their polar membrane lipids, accounting for 9,7 to 83,4% of total phospholipid side chains. Apart from ether-linked isoprenoids, straight-chain and monomethyl-branched hydrocarbons with chains ranging from C14 to C35 were also found in phospholipids from different soil types. Using liquid chromatography/mass spectrometry some of these side chains could be traced back to etherlipids similar to these found in thermophilic bacteria of the genera Aquifex and Thermotoga. The extended phospholipid method was employed within an integrated research project aimed at creating a sustainable land use system for peat soils in the „Donaumoos" region of Germany. Specifically, the influence of rewetting the heavily degraded peat soil on soil microorganisms was investigated using phospholipid profiling. Soil samples at a depth of 0-10 cm were taken from oxic and anoxic sites in November 1998, February 1999, May 1999 and September 1999, methane gas fluxes were also estimated at these time points. Since July 1998, the anoxic sites consisted of two basins planted with Typha sets, surrounded by a 1 m high dike and flooded with water from a slightly nutrient loaded draining ditch. The water levels in basin 1 and 2 were 40 and 20 cm, respectively. A nearby drained peat soil used as a grassland with significant oxic properties served as a reference plot and was investigated in the same manner. Phospholipid analyses revealed that Archaea contributed significantly to the microbial biomass in peatland soils: 26,0-38,8% of the estimated total microbial cells could be allocated to organisms of the domain Archaea. While the percentage of organisms belonging to the archaeal kingdom Euryarchaeota was higher in anoxic than oxic sites, the abundance of Crenarchaeota was highest in oxic sites. Extended phospholipid analysis lead to similar results as fluorescent in situ hybridization and DAPI staining (FISH/DAPI), when both approaches were applied to the same soil samples. However, 10-100 magnitudes higher cell numbers were estimated using the phospholipid assay than with the FISH/DAPI approach. Sampling date (= season) and oxic/anoxic properties yielded differences in the microbial community structure, as revealed by principal component analysis of the lipid biomarker data. Furthermore, it seems that microbial populations in the anoxic sites are still apparently in a phase of succession, even after one year of rewetting. Differences in methane fluxes could be related to differences in the colonisation of methanogenic and methanotrophic microorganisms in the three sites. According to PLEL profiling, Euyrarchaeota populations in anoxic sites showed distinct methanogenic properties. In addition, higher concentrations of PLFA characteristic for methanotrophic (= methane oxidising) microorganisms were found in the oxic reference plot.     «

During methodological development, phospolipid fatty acid (PLFA) analysis, already established in microbial ecology, was extended by estimating phospholipid etherlipids (PLEL) characteristic of archaeal microorganisms. Phospholipid etherlipid analysis is based on the estimation of ether-linked side chains. Therefore, the polar head group of the phospholipid molecule is removed to access the ether core lipid, releasing alkyl iodides after cleavage of the ether bonds with HI acid. During the subse...     »