Der Programmierte Zelltod (PCD) ist essentiell für die Entwicklung der Pflanze, im Speziellen für den Abbau nicht mehr benötigter Gewebe zur Rückführung von Nährstoffen an die weiterlebenden Teile der Pflanze. Ricinus (R. communis) speichert Öl und Eiweiß in einem lebenden Endosperm, das die Kotyledonen umgibt. Die Speicherstoffe werden während der Keimung mobilisiert und den Kotyledonen zugeführt. Der PCD des Endosperm-Gewebes wird eingeleitet, sobald dieser Transfer abgeschlossen ist. Ein spezielles Organell – die Ricinosomen – wurde im seneszierenden Endosperm keimender Ricinus-Samen entdeckt. Ricinosomen werden zu Beginn des PCD am Endoplasmatischen Retikulum gebildet und schütten im Endstadium des zellulären Zerfalls große Mengen einer Papain-ähnlichen Cystein-Endopeptidase mit C-terminalem KDEL-Motiv (CysEP) aus. Drei zur Ricinus CysEP homologe Cystein-Peptidasen mit C-terminalem KDEL-Motiv wurden in Arabidopsis identifiziert. In Arabidopsis-Pflanzen, die den Reporter Glucuronidase (GUS) unter der Kontrolle der drei entsprechenden Promotoren AtCEP1, AtCEP2 und AtCEP3 exprimieren, wurde eine spezifische Expression in generativen und vegetativen Geweben nachgewiesen, die in ihrer Entwicklung den Programmierten Zelltod erfahren. Ricinosomen und ihre CysEP spielen auch eine entscheidende Rolle für den Abbau bzw. Kollaps des Nucellus-Gewebes in reifenden Ricinus-Samen, um dem expandierenden, Speicherstoffe akkumulierenden Endosperm Raum zu geben. Ricinosomen und ihr Markerenzym CysEP finden sich exklusiv in Pflanzenzellen, und zwar speziell in letztlich kollabierenden Geweben. Die native Ricinus CysEP wurde kristallisiert und ihre Struktur mit einer Auflösung von 2,0 Å aufgeklärt. Die katalytische Tasche wurde durch den kovalent gebundenen Inhibitor H-D-Val-Leu-Lys-CMK eindeutig definiert. Untersuchungen der Spaltspezifität mit β-Casein als Substrat ergaben eine breite Substratspezifität, die sogar Prolin N- und C-terminal zur Spaltstelle akzeptiert. Dies steht in Einklang mit ihrer Funktion beim Abbau cytosolischer Proteine bzw. Zellwandproteine in der Endphase des PCD. Glyoxysomen sind in fettspeichernden Samen bei der Keimung an der Fettmobilisierung beteiligt. Einige glyoxysomale Matrixproteine werden als höhermolekulare Vorstufe im Cytoplasma synthetisiert und unter Abspaltung der Präsequenz in die Glyoxysomen importiert. In Nachbarschaft zur Spaltstelle findet sich charakteristischerweise ein Cystein. Die zur Abspaltung der N-terminalen Präsequenz notwendige Glyoxysomale (oder auch Peroxisomale) Processing Peptidase aus Pflanzen und Säugern war bisher nicht bekannt. Die Glyoxysomale Processing Peptidase wurde aus fettspeichernden Kotyledonen der Wassermelone (Citrullus vulgaris) über Säulenchromatographie, präparative native Isoelektrische Fokussierung und 2-D-Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Die GPP aus C. vulgaris tritt in zwei Formen auf, als 72 kDa-Monomer und als 144 kDa-Dimer. Die beiden Formen stehen miteinander im Gleichgewicht und konnten über Gelatine-Aktivitätsgele detektiert werden. In-vitro ließ sich die Gleichgewichtslage durch Ca2+-Entzug in Richtung Monomer und durch Ca2+-Zugabe in Richtung Dimer verschieben. Das Monomer scheint eine generell degradierende Protease zu sein und zeigt ein für eukaryontische Proteasen ungewöhnliches Temperatur-Optimum bei 45°C, ein pH-Optimum im basischen Bereich und ist durch denaturierte Proteine aktivierbar. Bei dem Dimer handelt es sich höchstwahrscheinlich um die Glyoxysomale Processing Peptidase, denn die für das Monomer nachgewiesene Substratspezifität (Φ-Arg/Lys↓) ist stark verschieden von der im Gemisch beider Proteasen gefundenen prozessierenden Substratspezifität (Cys-Xxx↓ bzw. Xxx-Cys↓). Die Sequenzierung des Arabidopsis-Genoms ergab drei vermutlich in den Peroxisomen lokalisierte Peptidasen, eine Deg-Protease, eine Pitrilysin-ähnliche Metallopeptidase und eine Lon-Protease. Spezifische Antikörper gegen die peroxisomale Deg-Protease aus Arabidopsis (Deg15) identifizieren die Wassermelonen-GPP als Deg15. Damit gehört die GPP/Deg15 in eine Gruppe Trypsin-ähnlicher Serin-Peptidasen mit E. coli DegP als Prototyp. Sie besitzt gleichwohl spezifische Eigenschaften und gehört damit einer neuen Untergruppe innerhalb der Deg-Peptidasen an.     «

Der Programmierte Zelltod (PCD) ist essentiell für die Entwicklung der Pflanze, im Speziellen für den Abbau nicht mehr benötigter Gewebe zur Rückführung von Nährstoffen an die weiterlebenden Teile der Pflanze. Ricinus (R. communis) speichert Öl und Eiweiß in einem lebenden Endosperm, das die Kotyledonen umgibt. Die Speicherstoffe werden während der Keimung mobilisiert und den Kotyledonen zugeführt. Der PCD des Endosperm-Gewebes wird eingeleitet, sobald dieser Transfer abgeschlossen ist. Ein spez...     »

Programmed cell death (PCD) is essential for the development of the plant. In one form of PCD the tissues or cells no longer required by the plant are degraded and the low molecular weight compounds transferred as nutrients to remaining living parts of the plant. Ricinus stores oil and protein in a living endosperm, which surrounds the cotyledons. The storage materials are mobilized during germination and supplied to the cotyledons. The PCD of the endosperm tissue is induced, as soon as this transfer is completed. A special organelle –the ricinosome– was discovered in the senescing endosperm of germinating Ricinus seeds. Ricinosomes are budded off the endoplasmatic reticulum (ER) at the beginning of the PCD and deliver in the final stage of cellular disintegration large quantities of a papain-like cysteine endopeptidase (CysEP) with a C-terminal KDEL motif. Three homologous cystein peptidases with a KDEL-tail were identified in Arabidopsis thaliana. The highly specific localization of the three CysEPs in cell groups and tissues of Arabidopsis plants was identified by expression of the reporter glucuronidase (GUS) with their endogenous promotors AtCEP1, AtCEP2 and AtCEP3. Each of these CysEPs marked a different pattern of PCD in generative and vegetative tissues. Ricinosomes and their CysEP play also a crucial role for the disassembly and/or collapse of the nucellus tissue in maturing Ricinus seeds, in order to make room for the expanding endosperm cells during synthesis of storage proteins and oil. Ricinosomes with their marker enzymes CysEP are exclusively found in plant cells, with preference for tissues destined for collapse. The native Ricinus CysEP was crystallized and its structure was solved at 2.0 Å resolution. The specificity subsites were clearly defined by covalent binding of the inhibitor H‑D-Val-Leu-Lys-CMK in the active site. Investigations of cleavage specificity with ß-casein as substrate resulted in a broad substrate specificity that even allowed prolin N- and C-terminal to the cleavage site. This is in accord with its putative function for disassembly of cytosolic and cell wall proteins in the final stages of PCD. In the first days of germination the endosperm of Ricinus seeds contain glyoxysomes which are involved in fat mobilization. Some glyoxysomal matrix proteins are synthesized as high-molecular precursor in the cytoplasm and the N-terminal propeptide is cleaved off upon import into the glyoxysomes. The neighbourhood of the cleavage site typically contains a cysteine. The glyoxysomal (or also peroxisomal) processing peptidase for removal of the N-terminal presequence in plants and mammals was so far unknown. It was purified from the fat-storing cotyledons of the watermelon (Citrullus vulgaris) by means of column-chromatography, preparative native isoelectric focusing and 2-D-polyacrylamide-gelelectrophoresis. The GPP from C. vulgaris appears in two forms, as a 72 kDa monomer and as a 144 kDa dimer. The two forms are in equilibrium with one another and could be detected with gelatin-activity gels. The equilibrium is shifted upon Ca2+-removal towards the monomer and upon Ca2+-addition towards the dimer. The monomer seems to be a generally degrading peptidase and shows a for eucaryotic proteases unusual temperature optimum at 45°C, a pH optimum in the basic range and is activated by denatured proteins. The dimer constitutes most likely the Glyoxysomal Processing Peptidase, since the substrate specificity proven for the monomer (Ф-Arg/Lys↓) is very different from the processing substrate specificity (Cys-Xxx↓/Xxx-Cys↓) found with the mixture of the mono- and dimeric forms. The Sequencing of the Arabidopsis Genoms resulted so far in the identification of three peptidases located in the peroxisomes, a Deg-protease, a pitrilysin-like metallopeptidase and a Lon-protease. Specific antibodies against the peroxisomal Deg-protease from Arabidopsis (Deg15) identifies the watermelon GPP as a Deg15. Thus the GPP/Deg15 belongs to a group of trypsin-like serine peptidases with E. coli DegP as prototype. Nevertheless the GPP/Deg15 possesses specific characteristics and is therefore to be assigned to a new sub-group within the Deg peptidases.     «

Programmed cell death (PCD) is essential for the development of the plant. In one form of PCD the tissues or cells no longer required by the plant are degraded and the low molecular weight compounds transferred as nutrients to remaining living parts of the plant. Ricinus stores oil and protein in a living endosperm, which surrounds the cotyledons. The storage materials are mobilized during germination and supplied to the cotyledons. The PCD of the endosperm tissue is induced, as soon as this tra...     »