Zinc is essential for the structural and functional integrity of cells and plays a pivotal role in the control of gene expression. Despite intensive research activities over the last decades, the molecular targets leading to the pleiotropic effects of zinc have only partially been identified. In this work, transcriptome and proteome analysis using the human colon adenocarcinoma cell line HT-29 as a model were performed to identify genes and proteins with altered steady state expression levels upon alteration of the cellular zinc status.For transcriptome profiling two commercially available DNA array formats were used and real-time RT-PCR/Northern blot analysis were employed for the independent confirmation of array results. DNA array analysis of HT-29 cells, exposed to a high but non-toxic zinc concentration identified an unexpectedly small number of molecular targets. However, most of the identified genes have so far never been linked to alterations in cellular zinc status. Unlike zinc supplementation, a low intracellular zinc concentration caused changes in the steady state mRNA levels of 309 genes; most of them with down-regulation. Genes identified as regulated based on microarray data encode proteins important for central pathways of intermediary metabolism and basic cellular functions such as signaling, cell cycle control and growth, vesicular trafficking, cell-cell interaction, cytoskeleton and transcription control. Proteome analysis by 2D-PAGE yielded 29 proteins that are regulated by zinc depletion and/or zinc supplementation. Thereof, 16 proteins were identified by MALDI-TOF-MS analysis. Most of the targets could be linked to an impaired state of cellular ATP production and cellular stress response. Comparison of data obtained from transcriptome and proteome analysis showed a good correlation in case of zinc depletion studies, whereas only a weak correlation was found in case of cells exposed to high medium zinc.Among the identified zinc-dependent genes, 9 were found to respond to a low as well as a high cellular zinc status with changes in expression levels. As those are obviously primarily zinc-dependent, it was investigated whether these genes are controlled by the zinc-finger transcription factor MTF-1. Using a conditional expression system and by employing an in-silico analysis for metal responsive elements (MREs) within promoters of zinc-sensitive genes, it became evident that Kruppel-like factor 4, hepatitis A virus cellular receptor 1 and complement factor B are three potential new target genes of MTF-1.In conclusion, the methods employed in the present thesis proved suitable to identify an impressive number of new molecular targets of zinc. The pattern of genes and proteins that respond to alterations in cellular zinc status may represent a reference for further studies to define the zinc regulon in mammalian cells.     «

Zinc is essential for the structural and functional integrity of cells and plays a pivotal role in the control of gene expression. Despite intensive research activities over the last decades, the molecular targets leading to the pleiotropic effects of zinc have only partially been identified. In this work, transcriptome and proteome analysis using the human colon adenocarcinoma cell line HT-29 as a model were performed to identify genes and proteins with altered steady state expression levels up...     »

Zink ist essentiell für die strukturelle und funktionelle Integrität von Zellen und spielt eine wichtige Rolle in der Genexpression. Obwohl die vielfältigen Effekte von Zink in den letzten Jahrzehnten Gegenstand intensiver Forschung waren, konnten die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen nur teilweise aufgeklärt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde am Model der humanen Dickdarmkrebszellinie HT-29 ein Screening auf Transkriptom- und Proteomebene durchgeführt, um Gene und Proteine zu identifizieren, die mit veränderten Expressionsspiegeln auf ein verändertes Zinkangebot (Mangel, Überschuß) reagieren.Für das Screening auf Transkriptionsebene wurden zwei unterschiedliche, kommerziell erhältliche DNA-Chip-Formate verwendet. Zur unabhängigen Bestätigung der Resultate dienten die real-time RT-PCR- und Northern Blot-Analyse. Die Array-Analyse von HT-29 Zellen, die einer hohen aber nicht-toxischen Zinkkonzentration ausgesetzt wurden, ergab eine unerwartet kleine Anzahl von verändert exprimierten Transkripten. Gleichwohl wurden die meisten der identifizierten Gene bislang nicht mit Veränderungen im Zinkangebot in Verbindung gebracht. Hingegen wiesen unter einem experimentellen Zinkmangel 309 Gene signifikante Veränderungen der mRNA-Spiegel auf; die meisten von ihnen waren vermindert exprimiert. Sie kodieren für Proteine, die eine wichtige Rolle im Intermediärstoffwechsel sowie für grundlegenden Funktionen der Zelle spielen, wie Signalweitergabe, Zellzykluskontrolle und -wachstum, Trafficking, Zell-Zell-Interaktion, Zytoskelettdynamik und Transkription. Die Proteomanalyse mittels 2D-PAGE ergab 29 Proteine, die in ihrer Expression durch Zinkmangel und/oder -zulage signifikant verändert waren. Von diesen konnten 16 Proteine mittels MALDI-TOF-MS identifiziert werden. Die Mehrzahl der Proteine ist beteiligt an der ATP-Produktion und der zellulären Stressantwort. Ein Vergleich der Daten der Transkriptom- und Proteomanalyse ergab eine gute Übereinstimmung der beiden Expressionsspiegel für die Zinkdepletierungsversuche, wohingegen nur eine schwache Korrelation für die Zinkzulageversuche nachweisbar war.Neun der identifizierten zink-abhängigen Gene waren sowohl unter Bedingungen eines niedrigen als auch eines hohen Zinkstatus differenziell exprimiert. Da somit die Expression dieser Gene primär zink-abhängig zu sein schien, wurde experimentell geprüft, ob sie unter der Kontrolle des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors MTF-1 (metal transcription factor-1) stehen. Durch Etablierung eines konditionalen Expressionssystems und mittels einer bioinformatischen Suche nach Response-Elementen in den Promotorsequenzen dieser Gene wurde gezeigt, daß Kruppel-like Factor 4, Hepatitis A virus cellular receptor 1 und Complement Factor B drei potentielle neue Targetgene von MTF-1 sind.Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß sich die angewendeten Screening-Methoden als geeignet erwiesen, um eine Vielzahl neuer Zielgene zu identifizieren, welche Änderungen des zellulären Zinkspiegels in Zellantworten übersetzen. Die identifizierten Marker bieten die Grundlage für weitere Studien, das Zink-Regulon in Säugetierzellen zu entschlüsseln.     «

Zink ist essentiell für die strukturelle und funktionelle Integrität von Zellen und spielt eine wichtige Rolle in der Genexpression. Obwohl die vielfältigen Effekte von Zink in den letzten Jahrzehnten Gegenstand intensiver Forschung waren, konnten die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen nur teilweise aufgeklärt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde am Model der humanen Dickdarmkrebszellinie HT-29 ein Screening auf Transkriptom- und Proteomebene durchgeführt, um Gene und Proteine zu iden...     »