The potentials of C-S β-lyases and lipases to generate sensorially active thiols from non-volatile sulfur-containing precursors were investigated. The substrates were synthesized by Michael-type addition of nucleophiles (cysteine, thioacetic acid) to α,β-unsaturated carbonyls (pulegone, E-2-hexenal). Their structures were elucidated by means of GC-MS, LC-MS and 1H/13C NMR. A cell-free extract obtained from Eubacterium limosum, a commercially available tryptophanase preparation from E. coli, and yeast (Saccharomyces cerevisiae) were used as sources for C-S β-lyases. For the lipase-catalyzed hydrolyses commercially available enzyme preparations of microbial, plant and animal origin were employed. The stereochemical course of the reactions was followed by capillary gas chromatography using modified cyclodextrins as chiral stationary phases. The addition of cysteine to the double bond of pulegone resulted in the preferred formation of the trans-configured diastereoisomeric products, irrespective of the configuration at position C1 of the starting material. 8-S-L-cysteinyl-p-menthan-3-one was accepted as substrate by the three β-lyase sources tested resulting in the liberation of 8-mercapto-p-menthan-3-one, a powerful flavoring substance exhibiting a “cassis”-type odor note. The cleavage was shown to proceed with only low enantioselectivity; a preference of the (1S,4S)-stereoisomer was observed for tryptophanase. Diastereoselectivity was more pronounced; tryptophanase and the extract from E. limosum exhibited a preference of the (1R,4S)- and (1S,4R)-diastereoisomers. Screening of β-lyases from other sources, e.g. plants in which thiols play important sensory roles, revealed cysteine conjugate β-lyase activities in passion fruits and in the leaves of blackcurrant and box tree. The product resulting from the reaction between E-2-hexenal and L-cysteine was shown to be a diastereoisomeric mixture of 2-(2-S-L-cysteinylpentyl)-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid. Treatment of the conjugate with tryptophanase from E. coli and the enzyme extract from E. limosum resulted in the formation of 3-mercaptohexanal. The reaction proceeded with a slight preference for the (S)-configured product, however with low conversion rate. The role of 3-S-L-cysteinylhexanal as substrate for β-lyases was demonstrated by in situ generation of this compound from 3-S-(N-acetyl-L-cysteinyl)hexanal using acylase. Opposite enantioselectivities were observed for the liberation of 3-mercaptohexanol, the key aroma compound occurring in yellow passion fruits and various grape musts, from 3-S-L-cysteinylhexanol by the enzyme preparation from E. limosum and tryptophanase, respectively. Various yeasts produced 3-mercaptohexanol starting from 2-(2-S-L-cysteinylpentyl)-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid as well as from 3-S-L-cysteinylhexanol. The reactions proceeded without preferential formation of one of the enantiomers. Structural effects on the activities of C-S β-lyases were investigated by employing synthesized analogues as substrates. The hydrolysis of 3-acetylthiohexanal was catalyzed by all lipases tested. The enzyme preparations varied significantly in terms of activity and enantioselectivity. The most pronounced enantioselectivity was observed for the hydrolysis of 3-acetylthiohexanal catalyzed by lipase B from Candida antarctica resulting in the (S)-configured thiol-product. Immobilization of the enzyme and the use of tert-butanol as co-solvent improved the enantioselectivity. Modification of the acyl moiety of the substrate by a bulkier moiety (3-benzoylthiohexanal) reduced conversion rates but had no significant impact on enentioselectivities. For most of the enzymes tested, activities and enantioselectivities for the hydrolysis of 3-acetylthiohexanol were significantly lower than those for the aldehyde substrate. The 3-acetylthio-compounds investigated possess attractive sensory properties. The odors of the stereoisomers differed significantly; only one of the enantiomers exhibited the pleasant citrus-type note. The data elaborated demonstrate that it is worthwhile to invest in methods to obtain optically pure (enriched) stereoisomers of sulfur-containing flavor compounds and to exploit the stereoselectivity of enzyme-based approaches. The properties revealed for β-lyases and lipases in the course of kinetic resolutions should be useful for preparative purposes as well as for further biogenetic studies.     «

The potentials of C-S β-lyases and lipases to generate sensorially active thiols from non-volatile sulfur-containing precursors were investigated. The substrates were synthesized by Michael-type addition of nucleophiles (cysteine, thioacetic acid) to α,β-unsaturated carbonyls (pulegone, E-2-hexenal). Their structures were elucidated by means of GC-MS, LC-MS and 1H/13C NMR. A cell-free extract obtained from Eubacterium limosum, a commercially available tryptophanase preparation from E. coli, and...     »

Das Potential von C-S β-Lyasen und Lipasen zur Freisetzung sensorisch aktiver Thiole aus nichtflüchtigen schwefelhaltigen Vorstufen wurde untersucht. Die Substrate wurden durch Michael-Addition von Nucleophilen (Cystein, Thioessigsäure) an α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen (Pulegon, E-2-Hexenal) synthetisiert. Ihre Strukturen wurden mittels GC/MS, LC-MS und 1H/13C NMR untersucht. Als Quellen für C-S β-Lyasen wurden ein aus Eubacterium limosum gewonnener zellfreier Extrakt, eine kommerziell erhältliche Tryptophanase aus E. coli sowie Hefe (Saccharomyces cerevisiae) verwendet. Für die Lipase-katalysierten Hydrolysen wurden kommerziell verfügbare Enzympräparate mikrobiellen, pflanzlichen und tierischen Ursprungs eingesetzt. Der stereochemische Verlauf der Umsetzungen wurde mittels kapillargaschromatographischer Untersuchungen auf chiralen stationären Phasen verfolgt. Die Addition von Cystein an die Doppelbindung von Pulegon resultierte in der bevorzugten Bildung der trans-konfigurierten diastereoisomeren Produkte, unabhängig von der Konfiguration an Position C1 des Ausgangsmaterials. Die eingesetzten β-Lyasen akzeptierten 8-S-L-Cysteinyl-p-menthan-3-on als Substrat und setzten 8-Mercapto-p-menthan-3-on, eine intensiv nach Cassis riechende Verbindung frei. Die Spaltung verlief mit nur geringer Enantioselektivität; für Tryptophanase war eine Bevorzugung des (1S,4S)-Stereoisomers zu beobachten. Die Diastereoselektivität war stärker ausgeprägt; Tryptophanase und der Extrakt aus E. limosum zeigten eine Bevorzugung der (1R,4S)- und (1S,4R)- Diastereoisomere. Ein Screening von β-Lyasen aus anderen Quellen, z.B. Pflanzen, in denen Thiole wichtige Aromastoffe darstellen, zeigte, dass Passionsfrüchte sowie die Blätter von Schwarzer Johannisbeere und Buchsbaum Cysteinkonjugat-β-Lyase-Aktivitäten aufwiesen. Das aus der Reaktion von E-2-Hexenal und L-Cystein resultierende Produkt konnte als 2-(2-S-L-Cysteinylpentyl)-1,3-thiazolidin-4-carbonsäure identifiziert werden. Die Umsetzung dieses Konjugats mit Tryptophanase aus E. coli bzw. dem Extrakt aus E. limosum führte zur Bildung von 3-Mercaptohexanal. Die Reaktion verlief unter leichter Bevorzugung des (S)-konfigurierten Produkts, jedoch mit nur geringer Umsatzrate. Die Rolle von 3-S-L-Cysteinylhexanal als Substrat für β-Lyasen wurde durch in situ Bildung dieser Komponente aus 3-S-(N-acetyl-L-cysteinyl)hexanal mittels Acylase aufgezeigt. Entgegengesetzte Enantioselektivitäten wurden für die Freisetzung von 3-Mercaptohexanol, der in Passionsfrüchten und verschiedenen Traubenmosten vorkommenden Schlüsselaromakomponente, aus 3-S-L-Cysteinylhexanol durch den Extrakt aus E. limosum bzw. Tryptophanase beobachtet. Verschiedene Hefen bildeten 3-Mercaptohexanol ausgehend sowohl von 2-(2-S-L-Cysteinylpentyl)-1,3-thiazolidin-4-carbonsäure als auch von 3-S-L-Cysteinylhexanol. Die Reaktionen verliefen ohne bevorzugte Bildung eines Enantiomers. Strukturelle Einflüsse auf die Aktivitäten von β-Lyasen wurden durch Umsetzung synthetisierter Substratanaloge untersucht. Die Hydrolyse von 3-Acetylthiohexanal wurde durch alle getesteten Lipasen katalysiert. Die Enzympräparate zeigten deutliche Unterschiede hinsichtlich Aktivität und Enantioselektivität. Die Lipase B aus Candida antarctica zeigte die am stärksten ausgeprägte Enantioselektivität und setzte die (S)-konfigurierte Thiol-Verbindung frei. Durch Immobilisierung des Enzyms und Einsatz von tert.-Butanol als zusätzliches Lösungsmittel konnte die Enantioselektivität gesteigert werden. Eine Modifizierung des Acylrestes im Substrat durch eine voluminösere Gruppe (3-Benzoylthiohexanal) verringerte die Umsatzrate, hatte jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Enanatioselektivität. Für die meisten der getesteten Enzympräparate waren Aktivität und Enantioselektivität für die Hydrolyse von 3-Acetylthiohexanol deutlich geringer als für die des Aldehydsubstrats. Die untersuchten 3-Acetylthioverbindungen besitzen attraktive sensorische Eigenschaften. Die Stereoisomere zeigten deutliche Unterschiede; nur eines der Enantiomere besaß die angenehme Zitrus-Note. Die erarbeiteten Daten zeigen, dass es lohnenswert ist, in Methoden zur Gewinnung optisch reiner (angereicherter) Stereoisomere schwefelhaltiger Aromastoffe zu investieren und die Stereoselektivität Enzym-katalysierter Reaktionen zu nutzen. Die für β-Lyasen und Lipasen im Zuge kinetischer Racematspaltungen aufgezeigten Eigenschaften sollten sowohl für präparative Anwendungen als auch für weitere biogenetische Studien von Nutzen sein.     «

Das Potential von C-S β-Lyasen und Lipasen zur Freisetzung sensorisch aktiver Thiole aus nichtflüchtigen schwefelhaltigen Vorstufen wurde untersucht. Die Substrate wurden durch Michael-Addition von Nucleophilen (Cystein, Thioessigsäure) an α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen (Pulegon, E-2-Hexenal) synthetisiert. Ihre Strukturen wurden mittels GC/MS, LC-MS und 1H/13C NMR untersucht. Als Quellen für C-S β-Lyasen wurden ein aus Eubacterium limosum gewonnener zellfreier Extrakt, eine kommerziell e...     »