In der vorliegenden Arbeit wurde einerseits untersucht, ob sich ein optischer Biosensor eignet um Deoxynivalenol in Getreideproben nachzuweisen. Andererseits wurde eine quantitative PCR entwickelt, mit der es möglich war das Spektrum der Trichothecene bildenden Fusarium spp. auf Getreide quantitativ nachzuweisen. Die quantitative PCR basiert auf der LightCycler-Technologie, die schnelle in vitro Amplifizierung von DNA mit gleichzeitiger Detektion in Echtzeit über Fluoreszenzmessung kombiniert. Als Fluoreszenzfarbstoff diente SYBR Green I, die Quantifizierung wurde anhand einer externen Standardkurve mit genomischer DNA von F. graminearum DSM 4527 durchgeführt. Das entwickelte PCR-Verfahren erlaubt die Quantifizierung der Menge an Templatemolekülen, die in einer Probe vorhanden sind sowie die Identifizierung des PCR-Produkts über seine Schmelztemperatur. Das Verfahren beruht auf dem Primerpaar Tox5, das spezifisch mit Teilen der Sequenz des tri5-Gens hybridisiert. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das die Synthese zu Trichodien katalysiert, der ersten Stufe in der Biosynthese aller Trichothecene. Die Größe des PCR-Fragments bestimmt die Zeitdauer der Extension. In Hinblick auf die Entwicklung einer Schnellmethode und durch den Umstand, dass bei hohen Ausgangskonzentrationen an Template-DNA mit den Tox5-Primern die Plateauphase der PCR sehr schnell erreicht wird, wurde ein neues Primerpaar abgeleitet. Die ToxHS-Primer, gleichfalls spezifisch zum tri5-Gen, erauben die Synthese eines 120 bp Fragments. Mit einem optimierten Reaktionspuffer und der Fluoreszenzdetektion bei erhöhter Temperatur wurde die Nachweisgrenze für das System auf 4 x 10-7 µg gereinigter Standard-DNA bestimmt. Im Probenmaterial (Weizen) war die minimale nachweisbare Quantität der Template-DNA 16 µg/kg, was 290 haploiden Genomen entspricht. Die neue Methode analysiert das Potential für die Toxinproduktion in Getreideproben. Daneben wird nicht nur lebendes, sondern auch abgestorbenes Myzel erfasst. Das heißt für die Praxis, dass eine mögliche Toxinkontamination detektierbar bleibt, auch wenn der Organismus bereits abgestorben ist. Mit dem hier entwickelten Verfahren ist die Analyse von 30 Getreideproben einschließlich Probenvorbereitung, PCR-Reaktion und Datenauswertung gegen einen externen Standard innerhalb von einer Stunde möglich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Korrelation zwischen DNA-Gehalt als Parameter für die Biomasse von Thrichothecene bildenden Fusarium spp. und deren Leittoxin Deoxynivalenol in Getreide gefunden. Die statistische Auswertung einer hinreichend großen Datenmenge (n = 300) erlaubte die Abschätzung der Konzentration an DON in der Probe über die Bestimmung der DNA-Konzentration. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf dem Nachweis von Deoxynivalenol in Getreideproben mittels eines Biosensors. Hierfür wurde DON so modifiziert, dass in der C-3 Position ein Linkerarm eingeführt wurde, über dessen Carbonylfunktion die Kopplung an Biotin möglich war. Das biotinylierte Antigen wurde auf einer mit Streptavidin beschichteten Sensorobenfläche immobilisiert. Für die Bestimmung des Toxins wurde ein indirekt kompetitiver Immunoassay verwendet. Die Messungen wurden im Biacore X-Gerät über Fließinjektionsanalyse durchgeführt. Das System wurde über eine DON-Verdünnungsreihe kalibriert. Der Assay hat einen Arbeitsbereich zwischen 0,13 und 10,0 ng Deoxynivalenol, äquivalent zu 390 ppb und 30 ppm DON in natürlich kontaminiertem Probenmaterial. Die kleinste nachgewiesene Konzentration lag bei 2,5 pg/µl, das entspricht einer Proben-kontamination von ~7,5 ppb DON. Die Regeneration des Systems wurde mit einem Impuls von 6 M Guanidinchlorid in 10 mM Glycin (pH 2,6) erreicht. Zur Verstärkung der Messsignale wurde ein sekundärer Antikörper verwendet. Es wurde gezeigt, dass eine Extraktionszeit von 10 min durchaus ausreichend ist, um DON quantitativ aus Getreideproben zu gewinnen. Bei der Aufreinigung des Rohextraktes über MycoSep-Säulen wurde eine durchschnittliche Wiederfindungsrate von 98,3 % für das sekundäre Antikörpersignal und von 104 % für das primäre Antikörpersignal gefunden. Mit dem hier entwickelten Biosensor beträgt die Dauer für die Bestimmung eines Messwertes ca. 4 min. Das bedeutet, dass die Messzeit für eine Probe einschließlich Probenextraktion und Aufreinigung auf 15 min minimiert werden kann. Diese Zeitdauer wird nach derzeitigen Kenntnisstand von keinem anderen Nachweisystem erreicht. Damit verbindet der Biosensor die Spezifität der Immunoassays mit einer schnellen konjugationsfreien Detektion des Messsignals mittels der SPR im Biacore-System.
«
In der vorliegenden Arbeit wurde einerseits untersucht, ob sich ein optischer Biosensor eignet um Deoxynivalenol in Getreideproben nachzuweisen. Andererseits wurde eine quantitative PCR entwickelt, mit der es möglich war das Spektrum der Trichothecene bildenden Fusarium spp. auf Getreide quantitativ nachzuweisen. Die quantitative PCR basiert auf der LightCycler-Technologie, die schnelle in vitro Amplifizierung von DNA mit gleichzeitiger Detektion in Echtzeit über Fluoreszenzmessung kombiniert. A...
»
Login
BibTeX