Mithilfe der denaturierenden HPLC wurde eine Mutationsanalyse des gesamten kodierenden Abschnitts des DPYD-Gens durchgeführt. Für jedes Exon und teilweise für einzelne Fragmente eines Exons wurden die optimale DHPLC-Temperatur und der Elutionsgradient anhand von Berechnung sowie experimentell ermittelt, so dass durch das jeweilige Chromatogramm eine definitive Zuordnung zu Wildtyp oder zu spezifischen bekannten Mutanten möglich wurde; stichprobenartige Kontrollen bestätigten in der Sequenzierung den erwarteten Genotyp. Somit wurde die Sequenzierung nur bei neuen oder unklaren Chromatogrammen bzw. Genotypen nötig. Ebenso konnte nach Evaluierung der exakten Analysenbedingungen mittels der optimierten DHPLC ein zeitlich wenig aufwendiges Screening einer großen Probandengruppe durchgeführt werden: bei einer durchschnittlichen Analysendauer von 6-8 min pro Einzelprobe und automatischer Probenapplikation konnten innerhalb relativ kurzer Zeit große Probenmengen bewältigt werden. Die Mutationsanalyse der Normalpopulation zeigt eine Vielfalt an Mutationen: sowohl im kodierenden als auch in Intron-Abschnitten des DPYD-Gens konnten insgesamt 23 Variationen identifiziert werden, davon drei bisher unbekannte Varianten. Im Patientenkollektiv konnte zusätzlich eine bisher nicht beschriebene Mutation entdeckt werden. Zur Klärung, welche der Mutationen für eine herabgesetzte Enzymaktivität und konsekutiv für DPD-Defizienz verantwortlich ist, wurden die genetischen Daten mit funktionellen Daten in Korrelation gesetzt: Zusammen mit DPD-Aktivitätswerten, Daten zur dreidimensionalen Proteinstruktur und statistischer Analyse konnten einige Mutationen als harmlose Polymorphismen beurteilt werden, während hingegen einige Mutationen der weiteren Untersuchung bedürfen. Schließlich lassen sich einige wenige Mutationen tendenziell als funktionsbeeinträchtigende bezeichnen: Die in der Literatur beschriebene Intron 14 Splice-Mutation trat in unserem Kollektiv nicht auf; jedoch lässt sich eine Funktionseinschränkung erklären: das Exon 14 wird herausgespleißt, somit fehlt die durch das Exon 14 kodierte Uracilbindestelle. In unserem Kollektiv trat die Mutation im Exon 4 auf, die hinlänglich aus der Literatur bekannt durch Wegfall dreier Basen ein verschobenes Leseraster bewirkt und folglich ebenso ein in der Funktionalität gestörtes Protein produziert. Durch die Korrelation mit der funktionellen Diagnostik lassen sich zwei Mutationen mit statistischer Signifikanz einer herabgesetzten Enzymaktivität zuordnen: 2846A>T (Asp949Val) und 1601G>A (DPYD*4, Ser534Asn); ebenfalls bei Betrachtung der Analyse der dreidimensionalen Struktur erhärtet sich der Hinweis auf eine Beeinträchtigung der Enzymfunktion bei vorliegenden Mutationen. Unsere Untersuchung an der Normalpopulation bestätigt frühere Studien, die eine Inzidenz von 1-3% von genetischen DPD-Defekten beschreiben. Deshalb ist das Risiko des Individuums, unter Chemotherapie mit Fluoropyrimidin-haltigen Substanzen eine schwere toxische Reaktion zu erleiden, zwar gering, jedoch nicht zu vernachlässigen. Somit ist ein prätherapeutisches Screening auf genetische Defekte mittels schneller und wenig zeit- und kostenintensiver Methoden indiziert: die Möglichkeit der DHPLC wäre diesem Zweck entsprechend. Jedoch bis zur endgültigen Differenzierung von harmlosen Polymorphismen und therapierelevanten Mutationen sind weitere Untersuchungen nötig: anschließend an die Analyse der Normalpopulation wurde mit einer Studie an einem Patientenkollektiv begonnen.     «

Mithilfe der denaturierenden HPLC wurde eine Mutationsanalyse des gesamten kodierenden Abschnitts des DPYD-Gens durchgeführt. Für jedes Exon und teilweise für einzelne Fragmente eines Exons wurden die optimale DHPLC-Temperatur und der Elutionsgradient anhand von Berechnung sowie experimentell ermittelt, so dass durch das jeweilige Chromatogramm eine definitive Zuordnung zu Wildtyp oder zu spezifischen bekannten Mutanten möglich wurde; stichprobenartige Kontrollen bestätigten in der Sequenzierun...     »

Purpose: Complete or partial loss of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) function has been described in cancer patients with intolerance to fluoropyrimidine drugs like 5-fluorouracil (5-FU) or Xeloda. The intention of this population study is to assess and to evaluate gene variations in the entire coding region of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene (DPYD), which could be implicated in DPD malfunction. Experimental Design: A cohort of 157 individuals was genotyped by denaturing high-performance liquid chromatography; 100 of these genotypes were compared with functional studies on DPD activity and mRNA expression. Results: Twenty-three variants in coding and noncoding regions of the DPYD gene were detected, giving rise to 15 common haplotypes with a frequency of >1%. Rare sequence alterations included a frameshift mutation (295-298delTCAT) and three novel point mutations, 1218G>A (Met406Ile), 1236G>A (Glu412Glu), and 3067C>T (Pro1023Ser). DPD enzyme activity showed high variation in the analyzed population and correlated with DPD mRNA expression. In particular, the novel variants were not accompanied with decreased enzyme activity. However, a statistically significant deviation from the median DPD activity of the population was associated with the mutations 1601G>A (Ser534Asn) and 2846A>T (Asp949Val). Conclusion: This work presents an analysis of DPYD gene variations in a large cohort of Caucasians. The results reflect the genetic and enzymatic variability of DPD in the population and may contribute to further insight into the pharmacogenetic disorder of DPD deficiency.     «

Purpose: Complete or partial loss of dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) function has been described in cancer patients with intolerance to fluoropyrimidine drugs like 5-fluorouracil (5-FU) or Xeloda. The intention of this population study is to assess and to evaluate gene variations in the entire coding region of the dihydropyrimidine dehydrogenase gene (DPYD), which could be implicated in DPD malfunction. Experimental Design: A cohort of 157 individuals was genotyped by denaturing high-perfo...     »