Fünf bis zehn Prozent der Knochenbrüche heilen nicht, so dass Patienten an schwersten Behinderungen und Einschränkungen ihrer Lebensqualität leiden und die Gesellschaft eine sozioökonomische Belastung in Höhe von Milliarden Euro zu tragen hat. Das rekombinante BMP-2-Protein wird bei der Behandlung von Knochenbrüchen eingesetzt. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit des Proteins werden jedoch supraphysiologische Dosen angewendet, was mit Nebenwirkungen wie heterotopem Knochenaufbau verbunden ist. Es war das Ziel dieser Arbeit, eine mRNA-basierte therapeutische Technologie für die Knochenheilung zu etablieren und den Wirksamkeitsnachweis in einem kritischen femoralen Knochendefektmodell bei Ratten zu erbringen.
Zu diesem Zweck wurde das Konzept einer osteoinduktiven transkript-aktivierten Matrix (o-TAM) übernommen und optimiert. Die hier entwickelte o-TAM besteht aus einer Lipidoid-Nanopartikelformulierung eines chemisch modifizierten mRNA (cmRNA)-Konstrukts, das für das nnochenmorphogenetische Protein (BMP)-2 kodiert, das auf Kollagenschwämme geladen ist. Die o-TAM wurde so konzipiert, dass sie in einen Knochendefekt eingebracht wird, um von Zellen besiedelt zu werden, die innerhalb der o-TAM-Matrix transfiziert werden und so das kodierte BMP-Protein produzieren. Dies würde zu einer osteogenen Differenzierung auf autokrine und parakrine Weise und zu einer verbesserten Knochenheilung führen.
Daher wurde ein neues chemisch modifiziertes mRNA (cmRNA)-Konstrukt, das für das Knochenmorphogenetische Protein (BMP)-2 mit verbesserten osteogenen Eigenschaften kodiert, entworfen und durch in vitro-Transkription hergestellt. Ein stromaufwärts gelegener offener Leserahmen in der 5'-UTR und ein Polyadenylierungselement sowie ein AU-reicher Trakt in der 3'-UTR der menschlichen Wildtypsequenz wurden entfernt. Anstelle der Wildtyp- 5'-UTR wurde ein Translationsinitiator von kurzen UTRs (TISU) stromaufwärts der kodierenden Sequenz platziert und 5-Jodo-modifizierte Pyrimidin-Nukleotide in die Sequenz eingeführt, um die Immunogenität der mRNA zu minimieren.
Im ersten Teil dieser Arbeit zeigte die neue TISU BMP-2 cmRNA eine robuste BMP-2-Produktion in vitro in Zelllinien (HEK293 und MC3T3) und Primärzellen (aus Muskel isolierte mesenchymale Stammzellen). Die Stammzellen zeigten zusätzlich eine Hochregulation sowohl osteogener als auch angiogener Gene bei der TISU BMP-2 cmRNA-Transfektion. Die in vivo osteogenen Eigenschaften der TISU BMP-2 cmRNA wurden in einem kritisch großen femoralen Knochendefekt bei der Ratte untersucht. Tiere, die mit TISU BMP-2 cmRNA behandelt wurden, zeigten eine überlegene Knochenbildung, die die endochondrale Ossifikation zu rekapitulieren schien, während die Knochendefekte in den Kontrollgruppen überhaupt keine Brücke bildeten. Die höhere der beiden in diesem Modell untersuchten Dosen zeigte eine signifikant größere Neubildung von Gewebe. Darüber hinaus wurde auch im Heilungsbereich von TISU BMP-2 cmRNA-behandelten Tieren eine verbesserte Vaskularisation festgestellt.
Da im ersten Teil der Studie eine Tendenz zu einer Dosiswirkung beobachtet wurde, haben wir uns entschieden, die Dosis-Wirkungsbeziehung über einen größeren Bereich (5 µg, 10 µg, 25 µg, 50 µg) zu untersuchen, wobei TISU BMP-2 cmRNA vor der Operation direkt auf Kollagenschwamm geladen wurde, ohne die o-TAM gefrierzutrocken. Die Ergebnisse der Mikro-Computertomographie zeigten deutlich die dosisabhängige Knochenbildung. Die 50 µg TISU-Gruppe zeigte nicht nur die beste Knochenheilung unter allen Gruppen, sondern es wurde auch noch mehr Knochenbildung festgestellt als bei der Anwendung von 11 µg rekombinantem BMP-2-Protein. Diese Ergebnisse wurden durch histologische Analysen bestätigt. Als eine Luziferase-kodierendes TAM innerhalb des Knochendefektes platziert wurde, zeigte die Biolumineszenz-Bildgebung, dass die mRNA auf den Defektbereich beschränkt war. Die Zytokinexpression nach der Operation zeigte keine signifikante Immunogenität der TISU BMP-2 cmRNA im Vergleich zur Negativkontrollgruppe.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Ergebnisse dieser Arbeit eine vielversprechende Technologie für die Behandlung von nicht heilenden Knochendefekten und eine vielversprechende Alternative zu rekombinantem BMP-2 oder gentherapeutischen Ansätzen zur Knochenregeneration darstellen.
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Fünf bis zehn Prozent der Knochenbrüche heilen nicht, so dass Patienten an schwersten Behinderungen und Einschränkungen ihrer Lebensqualität leiden und die Gesellschaft eine sozioökonomische Belastung in Höhe von Milliarden Euro zu tragen hat. Das rekombinante BMP-2-Protein wird bei der Behandlung von Knochenbrüchen eingesetzt. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit des Proteins werden jedoch supraphysiologische Dosen angewendet, was mit Nebenwirkungen wie heterotopem Knochenaufbau verbunden ist. Es...
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