Neurological diseases are often accompanied by neuronal loss. As neurons can only regenerate to a very limited extent, deciphering the mechanisms that cause neurodegeneration is an important step towards targeted therapies. Reactive oxygen species (ROS) have been implicated in neurodegeneration as possible molecular mediators of cellular damage. ROS are generated during the inflammatory burst of neutrophils and macrophages/microglia, as well as during mitochondrial oxidative phosphorylation. ROS can be detrimental to cells and tissues by oxidizing biomolecules like DNA, lipids or proteins, but can also act as cellular signaling molecules under physiological conditions. The study of ROS is notoriously difficult as ROS form intricate networks of short-lived and inter-convertible species. Therefore it was until recently not possible to directly visualize ROS and their effects in vivo. In my thesis work, I aimed to establish such in vivo methods in order to measure redox changes that are caused by ROS in intact neurons. For this purpose, I generated with cooperating partners novel transgenic mouse lines (Thy1-mito-Grx1-roGFP2 and Thy1-mito-roGFP2-Orp1), which express redox sensors in their neuronal mitochondria. Additionally, I developed further strategies to co-visualize mitochondrial pH, calcium and potential dynamics. By using wide-field, confocal and 2 photon in vivo microscopy, I could quantify redox changes in single mitochondria under physiological conditions, as well as in murine disease models of acute neurodegeneration (axon transection, nerve crush, spinal cord injury), chronic neurodegeneration (amyotrophic lateral sclerosis) and in neuroinflammatory conditions (experimental autoimmune encephalitis, a model of multiple sclerosis). I obtained the following results: (1) Under physiological conditions and in the absence of activity, the mitochondrial glutathione pool is almost completely reduced, indicating that mitochondrial redox levels are tightly regulated and independent of organelle location or movement. When axons are electrically stimulated, the mitochondrial redox potential is elevated in axons and synapses. (2) Mitochondria in PNS and CNS axons show spontaneous redox signals, which are accompanied by reversible shape changes and that we dubbed “mitochondrial contractions.” During these contractions, mitochondria transiently shorten by ~ 50% of their relaxed length and their glutathione pool reversibly oxidizes. A reversible drop of the mitochondrial inner membrane potential and a short alkaline spike of the matrix pH followed by a long lasting matrix acidification accompany the contraction. Matrix calcium levels do not change during the contraction. The frequency of mitochondrial contractions increases during extrinsic and intrinsic oxidative stress as well as during electrical activity. (3) Mechanistically, complex I activity is necessary for the initiation of contractions as well as for the oxidative shift of the redox potential. (4) Pharmacological manipulations inducing and blocking uncoupling proteins (UCPs) showed that these are activated during the contraction and that they sustain the long lasting drop in the mitochondrial inner membrane potential and the acidification. (5) Under pathological conditions e.g. during laser axotomy as well as during crush injury to peripheral nerve axons, a spreading wave of mitochondrial oxidation is initiated at the injury site. In damaged axons, the mitochondrial contraction frequency is increased ~4-fold, before mitochondria round up and fragment permanently and acute axonal degeneration sets in. A number of mitochondria also show an increase in contraction length of which some become irreversible. (6) In vivo imaging during laser axotomy in the spinal cord of living mice established a similar sequence of events and revealed further mechanisms: First, the presence of extracellular calcium and its injury-induced influx into axons is necessary and sufficient to cause mitochondrial oxidation and rounding. Knock-out of cyclophilin D, which is part of the mitochondrial transition pore, reduces the mitochondria pathology seen after axotomy. Preventing the oxidation of the mitochondrial glutathione pool by genetic and pharmacological means does not prevent mitochondrial shape changes. (7) In a model of ALS (SODG93A), mitochondria show severe oxidative changes that correlate with the disease course. In SODG93A mice, mitochondrial contractions are increased in frequency and last longer compared to wild-type controls.      «

Neurological diseases are often accompanied by neuronal loss. As neurons can only regenerate to a very limited extent, deciphering the mechanisms that cause neurodegeneration is an important step towards targeted therapies. Reactive oxygen species (ROS) have been implicated in neurodegeneration as possible molecular mediators of cellular damage. ROS are generated during the inflammatory burst of neutrophils and macrophages/microglia, as well as during mitochondrial oxidative phosphorylation. ROS...     »

Neurologische Erkrankungen gehen häufig mit neuronalem Zelltod einher. Da Nervenzellen nur eine geringe Regenerationsfähigkeit besitzen, ist es wichtig die genauen Ursachen und Mechanismen für den Zelltod herauszufinden. Dies wäre auch ein erster möglicher Schritt hin zu spezifischeren Therapien. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hoch reaktive Moleküle, die neurodegenerative Prozesse hervorrufen können. ROS entstehen während des oxidativen "Bursts" von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen/Mikroglia sowie in der Atmungskette von Mitochondrien. Durch die Oxidation von DNA, Proteinen und Lipiden können ROS direkt Zellen und Gewebe schädigen. ROS fungieren aber auch als zelluläre Signalmoleküle. Die Untersuchung von ROS wird dadurch erschwert, dass ihre Halbwertzeit sehr kurz ist und sie schnell umgewandelt und abgebaut werden. Daher konnten ROS bisher nicht in vivo untersucht werden. Das Ziel der hier vorgelegten Arbeit ist es, Methoden zur In-vivo-Messung von Redoxveränderungen und Radikalstress, die in physiologischen und pathologischen Situationen auftreten, zu entwickeln. Dafür habe ich in Kooperation neue transgene Mauslinien erzeugt (Thy1-mito-Grx1-roGFP2 und Thy1-mito-roGFP2-Orp1), die Redoxsensoren in neuronalen Mitochondrien exprimieren. Zudem kamen weitere Biosensoren zum Einsatz, um gleichzeitig ablaufende mitochondriale pH-, Potential- und Kalzium-Veränderungen zu quantifizieren. Durch den Einsatz von in vivo Mikroskopieverfahren konnte ich Redoxdynamiken in einzelnen Mitochondrien unter physiologischen und pathologischen Bedingungen messen. Es kamen Modelle von Rückenmarkstrauma, peripherer Nervenverletzung, Amyotropher Lateralsklerose sowie Multipler Sklerose zum Einsatz. In meiner Arbeit habe ich folgende Ergebnisse erzielt: (1) Unter Ruhebedingungen ist das mitochondriale Redoxpotential stark reduziert. Dieses ist genau reguliert und unabhängig vom Transportzustand von Mitochondrien. Bei elektrischer Aktivität des Axons steigt das Redoxpotential von axonalen und synaptischen Mitochondrien an. (2) Mitochondrien im ZNS und PNS zeigen spontane Redoxsignale, die mit einer reversiblen Formveränderung einhergehen, die wir als „mitochondriale Kontraktionen“ benannt haben. Während der Kontraktionen verkürzen sich Mitochondrien reversibel um ~50% ihrer normalen Länge und oxidieren. Zudem fällt das Potential der inneren Mitochondrienmembran reversibel ab und es kommt zu einem schnellen pH Anstieg, der von einem lang anhaltenden pH Abfall gefolgt ist. Die Frequenz der Kontraktionen steigt bei oxidativem Stress und elektrischer Stimulation an und fällt bei Gabe von Antioxidantien ab, (3) Die Aktivität von Komplex I ist sowohl für die Initiation der Kontraktion sowie für den oxidativen "Burst" notwendig. (4) Durch pharmakologische Manipulationen konnte gezeigt zeigen werden, dass "Uncoupling Proteine" während der Kontraktion aktiviert werden und für die lang-anhaltende mitochondriale Ansäuerung verantwortlich sind. (5) Nach einer Axotomie oxidieren Mitochondrien ausgehend von der Transektionsstelle. Die Anzahl der Kontraktionen nimmt hier um das ~4-fache zu, bevor Mitochondrien abrunden oder fragmentieren. (6) Durch In-vivo-Messungen konnte ich ähnliche Abläufe in einem Modell von Rückenmarkstrauma zeigen. Mechanistisch ist ein Kalzium-Einstrom in das Axon, ausgehend von der Transektionsstelle, hinreichend und notwendig, um die mitochondriale Pathologie auszulösen. Der Knockout von Cyclophilin D, eine Komponente der mitochondrialen "Transition Pore", verringert die mitochondriale Pathologie nach Axotomie. Die alleinige Blockierung der Oxidation durch Antioxidantien oder die genetische Überexpression von MnSOD verhindert die mitochondriale Abrundung nicht. (7) In einem Modell der amyotrophen Lateralsklerose (SODG93A) zeigen Mitochondrien im Erkrankungsverlauf zunehmend oxidative Veränderungen. Zudem finden sich gehäuft mitochondriale Kontraktionen, die in ihrer Zeitdauer verlängert sind.      «

Neurologische Erkrankungen gehen häufig mit neuronalem Zelltod einher. Da Nervenzellen nur eine geringe Regenerationsfähigkeit besitzen, ist es wichtig die genauen Ursachen und Mechanismen für den Zelltod herauszufinden. Dies wäre auch ein erster möglicher Schritt hin zu spezifischeren Therapien. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind hoch reaktive Moleküle, die neurodegenerative Prozesse hervorrufen können. ROS entstehen während des oxidativen "Bursts" von neutrophilen Granulozyten und Makrophag...     »