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Original title:
Investigation of the bovine immune response to repeated vaccinations against Clostridium difficile 
Translated title:
Untersuchung der bovinen Immunantwort auf wiederholte Impfungen gegen Clostridium difficile 
Year:
2019 
Document type:
Dissertation 
Institution:
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan 
Advisor:
Pfaffl, Michael W. (Prof. Dr.) 
Referee:
Pfaffl, Michael W. (Prof. Dr.); Windisch, Wilhelm (Prof. Dr.) 
Language:
en 
Subject group:
BIO Biowissenschaften 
Keywords:
Clostridium difficile, dairy cows, immunization, leukocytes, somatic cell count, cytokines, gene expression, mammary gland, supramammary lymph node 
Translated keywords:
Clostridium difficile, Milchkühe, Immunisierung, Leukozyten, Somatische Zellzahl, Zytokine, Genexpression, Euter, Supramammärer Lymphknoten 
TUM classification:
BIO 780d; CHE 880d 
Abstract:
The pathogen Clostridium difficile (C. diff.) causes severe diarrhoea in humans. Almost one of three patients suffered from C. diff. infection undergoes recurrences due to failed antibiotic treatment. The supplementary administration of a bovine whey protein concentrate enriched with anti-C. diff. IgA may improve the treatment success of antibiosis by diminishing the rate of recurrences as proven previously by v. Dissel et al. (2005). The production of bovine milk containing anti-C. diff. IgA requires the immunization of dairy cows against the virulent factors of C. diff.. The object of this doctoral thesis is to investigate the bovine immune response to repeated vaccinations against C. diff.. Nine primiparous Brown Swiss cows were vaccinated several times against the pathogen within the 18-month treatment period. Different types of vaccines, containing inactivated C. diff. and the toxoids / toxins A and B, were administered nasally (MucoCD-N) and parenterally via injection (MucoCD-I batches A, B). The treated cows were divided into low responder (LR) and high responder (HR) cows measured by the level of anti-C. diff. milk IgA. The associated threshold was set at 8.00 μg / mL anti-C. diff. milk IgA. Untreated Brown Swiss cows were used as controls. The following investigations were performed to determine treatment effects: veterinary monitoring of the treated cows' health; milk yield recording by use of the TRU-Test milk meter; testing of the milk composition by means of the Fourier-transform infrared spectroscopy for milk fats and proteins plus fluorescence flow-cytometry for somatic cell counts (SCC); total cell counting of peripheral blood leukocytes (PBL); differential cell counting (DCC) of SCC and PBL by aid of light microscopy; IgA quantification in milk and blood with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); gene expression analysis of receptors and mediators associated with the immune system in SCC and PBL with the real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR); correlation analysis of milk IgA and the main dairy production factors or rather DCC and associated gene expression data using the statistic software, SigmaPlot 11.0; immunohistochemically examination of different lymphocytes in mammary gland (MG) and supramammary lymph node (SLN) tissues. The health of the treated cows was impaired after injecting MucoCD-I batch A, which contained an imbalanced mixture of C. diff. toxoids / toxins A and B. As a result, milk yield and quantities of milk fats and proteins (P < 0.05) were significantly diminished in early lactation of the treated cows compared to the control. The anti-C. diff. and total IgA concentrations in HR's milk were significantly higher up to 80% related to the "before treatment control" values (BTC) and the measurement values in LR's milk at any lactation stage. Only in the late lactation, the LR's total milk IgA differed significantly from the associated BTC by roughly 47%. Total and anti-C. diff. IgA contents were affected more in milk than in blood due to the vaccinations. The total SCC of milk were untouched by the treatment. In blood, a short-term leukopenia followed by a leukocytosis were induced by application of MucoCD-I batch A. Significant changes in DCC of SCC and PBL among LR and HR were only partially treatment-related. Generally, the treatment influenced stronger the gene regulations in PBL than in SCC. The significantly different gene regulations in PBL and SCC among the treated groups were primarily triggered in response to MucoCD-I batch A. Especially the gene expressions of the chemokines / cytokines like CXCL8, IL1β, IL12β and IFNγ in PBL as well as lactoferrin and also IFNγ in SCC were significantly different between LR and HR. During the immunization period with MucoCD-I batch B, the treated groups' gene expressions were predominantly synchronized. They differed significantly from the control in case of CXCL8, IL6, IL12β, IFNγ, IL2, TLR2, CD3δ, CD4 and CD126 in PBL and for lactoferrin, TNFα, IL6, IL12β, CCL20 and CXCL3 in SCC. At no time of the treatment, the gene expressions of the epithelial IgA cell receptor PIGR were altered. The correlations among total or anti-C. diff. milk IgA and the main dairy production factors were determined as weak (r < 0.5). A significant linear dependency existed between anti-C. diff. and total milk IgA (r = 0.69). The correlation analysis of DCC and associated gene expression data revealed strong interrelationships between the SCC percentages of neutrophilic granulocytes and the related cell surface determinants C5AR1 and CXCR2 (r > 0.8) and a middle interrelationship between the SCC percentages of lymphocytes and the plasma cell marker CD126 (r = 0.75). The median population sizes of CD4+ and CD8+ T-cells as well as IgA+ antibody secreting cells in MG and SLN tissues of HR were predominantly larger than in those of LR and control. In conclusion, the persistent production of C. diff. specific IgA in milk depends on two important factors: a potent and well-tolerated C. diff. vaccine capable to induce a primarily mucosa-related immune response, and sensitive dairy cows as recipients. In advance, HR cows might be preselectable by in vitro testing of their PBL when challenged with C. diff. antigens and followed by gene expression analysis of CXCL8, IL1β, IL12β and IFNγ to check the induction of these genes. Overall, the following assumptions were deduced from the presented results and recommended as topics of subsequent investigations: • In response to repeated immunizations against C. diff., HR cows activated the humoral response to antigen directed by TH2-lymphocytes, whereas LR cows emphasized rather the cellular immune response controlled by TH1-lymphocytes, as indicated by the gene expression profiles of the chemokines / cytokines. Because the PIGR gene expressions were unaffected by the immunization, the epithelial transport capacity would not be a limiting factor for the secretion of milk IgA. The intensive homing of lymphocytes to the MG and SLN - as determined in HR's tissues - is crucial prerequisite for the persistent production of anti-C. diff. milk IgA. 
Translated abstract:
Der Krankheitserreger Clostridium difficile (C. diff.) verursacht gravierende Durchfälle beim Menschen. Annähernd ein Drittel an C. diff. erkrankten Patienten erfahren multiple Reinfektionen wegen fehlgeschlagener antibiotischer Behandlung. Die zur Antibiose supplementäre Verabreichung eines mit anti-C. diff. IgA angereicherten bovinen Molkenprotein-Konzentrats kann den Behandlungserfolg in Form geringerer Rückfallraten verbessern (van Dissel et al., 2005). Die Herstellung von bovinem anti-C. diff. Milch-IgA erfordert die Immunisierung von Milchkühen gegen die C. diff. typischen Virulenzfaktoren. In der vorliegenden Dissertation ist die bovine Immunantwort auf wiederholte Impfungen gegen C. diff. untersucht worden. In einem Behandlungszeitraum von 18 Monate wurden neun erstkalbige Brown Swiss Kühe wiederholt gegen C. diff. geimpft. Verschiedene Impfstoffvarianten wurden nasal (MucoCD-N) und parenteral per Injektion (MucoCD-I Chargen A und B) verabreicht. Die gegen C. diff. geimpften Kühe wurden abhängig vom anti-C. diff. IgA Gehalt in der Milch in "Low Responder" (LR) und "High Responder" (HR) eingeteilt. Der zugehörige Grenzwert lag bei 8,00 μg / mL anti-C. diff. Milch-IgA. Unbehandelte Brown Swiss Kühe wurden als Kontrolltiere verwendet. Zur Feststellung von Behandlungseffekten wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: tierärztliche Beurteilung der Tiergesundheit; Erfassung der Milchleistungsdaten inklusive des somatischen Milchzellgehaltes (SCC); Feststellung der Gesamtzahl peripherer Blutleukozyten (PBL); lichtmikroskopische Untersuchung der Differentialzellbilder (DCC) von SCC und PBL; Messung der IgA-Konzentrationen in Milch und Blut mit dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA); Genexpressionsanalysen von immunsystemrelevanten Zellrezeptoren und Botenstoffen in Milch- und Blutzellen mit der quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR); Korrelationsanalyse von den Milch-IgA-Messwerten und Milchproduktionsfaktoren sowie von DCC und zughörigen Genexpressionsdaten mit SigmaPlot 11.0; immunhistochemischer Nachweis definierter Lymphozytentpyen in Eutergewebe (MG) und supramammären Lymphknotengewebe (SLN). Die Impfung mit der MucoCD-I Charge A beeinträchtigte den Gesundheitszustand der behandelten Kühe aufgrund der unausgewogenen Toxoid/Toxin-Mixtur in dieser Impfstoffcharge. In der Folge waren in der Frühlaktation sowohl die durchschnittlichen Milchmengen als auch die Milchfette und -proteine der beiden behandelten Tiergruppen gegenüber der Kontrollgruppe signifikant reduziert (P < 0.05). Die Konzentrationen von anti-C. diff. und Gesamt-IgA in der HR-Milch überstiegen unabhängig vom Laktationsstadium signifikant um bis zu 80% die entsprechenden Kontrollwerte vor Behandlungsbeginn (BTC) und die Messwerte in der LR-Milch. Lediglich in der Spätlaktation war das Gesamt-IgA in der LR-Milch um etwa 47% signifikant erhöht gegenüber dem BTC. Die Konzentrationen von anti-C. diff. und Gesamt-IgA in der Milch waren von den C. diff. Impfungen stärker beeinflusst als die im Blut. Der SCC blieb von den C. diff. Impfungen unberührt. Im Blut wurden durch die injizierte MucoCD-I Charge A eine kurzweilige Leukopenie und eine nachfolgende Leukozytose festgestellt. Die in den Milch- und Blut-DCC von LR und HR festgestellten signifikanten Änderungen wurden nicht ausschließlich vom Impfprogramm verursacht. Generell beeinflusste die Behandlung die Genregulationen in den PBL deutlicher als die in den SCC. Unterschiedliche Genregulationen in PBL und SCC von LR und HR traten vornehmlich nach der Verabreichung von MucoCD-I Charge A auf. Insbesondere die Gene für die Chemokine / Zytokine CXCL8, IL1β, IL12β und IFNγ in PBL sowie Lactoferrin und auch IFNγ in SCC waren von LR und HR signifikant unterschiedlich exprimiert. Während der Immunisierung mit MucoCD-I Charge B entwickelten sich die Genexpressionen der behandelten Gruppen überwiegend gleichförmig. Sie unterschieden sich signifikant von denen der Kontrollgruppe für CXCL8, IL6, IL12β, IFNγ, IL2, TLR2, CD3δ, CD4 und CD126 in den PBL sowie für Lactoferrin, TNFα, IL6, IL12β, CCL20 und CXCL3 in den SCC. Zu keinem Behandlungszeitpunkt waren die Genexpressionen für den epithelialen IgA-Zellrezeptor PIGR verändert. Für die Konzentrationen von anti-C. diff. und Gesamt-IgA in der Milch behandelter Tiere wurde eine deutliche lineare Abhängigkeit nachgewiesen (r = 0.69). Die Korrelationen beider IgA-Messwerte mit den Milchproduktionsfaktoren wurde als schwach (r < 0.5) bewertet. Der prozentuale Anteil von neutrophilen Granulozyten im SCC und die Genexpressionsdaten für die zugehörigen Zelloberflächendeterminanten C5AR1 und CXCR2 korrelierten stark (r > 0.8). Eine durchschnittliche lineare Abhängigkeit wurde für den prozentualen Anteil von Lymphozyten im SCC und dem Plasmazellmarker CD126 festgestellt (r = 0.75). In den MG- und SLN-Geweben der HR waren die mittleren Populationsgrößen von CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie von IgA+ Antikörper produzierenden Zellen (ASC) überwiegend größer als die von LR und Kontrolltieren. Abschließend ist festzustellen, dass eine anhaltende Produktion von anti-C. diff. Milch-IgA von zwei wesentlichen Faktoren abhängt: einem wirksamen und gut verträglichen C. diff. Impfstoff, der es vermag eine primär Mukosa-assoziierte Immunantwort hervorzurufen, und von sensitiv auf den Impfstoff reagierenden Milchkühen. Solche HR-Kühe wären zukünftig im Voraus selektierbar, indem deren PBL mit C. diff. Antigenen in vitro getestet und nachfolgend mittels Genexpressionsanalysen die Induktion von CXCL8, IL1β, IL12β und IFNγ beurteilt werden. Folgende Annahmen, deren Überprüfung Folgeuntersuchungen erfordern, lassen sich anhand der vorliegenden Ergebnisse formulieren: • Gemessen an den Chemokin- / Zytokin-Genexpressionen aktivieren HR-Kühe eine von TH2-Lymphozyten kontrollierte humorale Immunantwort auf die C. diff. Impfungen und LR-Kühe eine von TH1-Lymphozyten regulierte zelluläre Immunantwort. Die vom Impfprogramm unbeeinflussten PIGR Genexpressionen deuten auf eine nicht von der epithelialen IgA-Transportkapazität limitierten Milch-IgA Sekretion hin. Die intensive Besiedelung von MG- und SLN-Geweben mit T-Lymphozyten und IgA+ ASC - wie in diesen Geweben der HR nachgewiesen - ist eine entscheidende Voraussetzung für die anhaltend anhaltende Produktion von anti-C. diff. Milch-IgA. 
Oral examination:
01.10.2019 
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Last change:
15.10.2019