Protein kinases are among the most intensively studied cellular signaling molecules in normal biology as well as many pathophysiological events, such as cancer. So far, numerous aberrant kinases have been revealed to be involved in most if not all the stages of tumorigenesis. Therefore, characterization of the cancer in a kinome-centric way may offer new insight of therapeutic invention. In this study, a kinase centric chemical proteomics assay (Kinobead) in conjunction with quantitative mass spectrometry is established and optimized, which enable quantitatively profiling around 150 kinases in parallel within 4% and 8% overall variance between technical and biological replicates respectively. First, it is employed to investigate 34 head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines resulting in 146 quantified kinases, of which 42 kinases showed statistically significant (p<0.05) expression inter-cell lines. Additional loss of function experiment using siRNA in high- and low- expressing cell lines further identified kinases including EGFR, EPHA2, LYN, JAK1, WEE1 and NEK9 involved in cell survival and proliferation. Among these, EGFR is confirmed as a drug target and EPHA2 is revealed to be novel drug target. Both contribute to around 20% and 15% of the HNSCC cell lines respectively. This notion is underscored by immunohistochemical analyses showing that high EGFR and EPHA2 expression is detected in a subset of HNSCC tissues. Downstream signaling pathway analysis suggests that EPHA2 promotes the cell proliferation via activating AKT and ERK signaling pathway. In addition the several significant candidates are the potential targets of the approved potent pan-SRC family kinase inhibitor dasatinib, which significantly reduces some but not all of HNSCC cell lines. These findings may lead to new therapeutic options for HNSCC patients. This may ultimately lead to a more rational approach to individualized cancer diagnosis and therapy.
Second, together with a global approach, kinobead based profiling is applied to study the HSP90 dependent proteome, which enriches in signal transducer including many kinases, by investigating the protein response upon the HSP90 inhibition. Employing stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) and quantitative mass spectrometry, >6,200 proteins are identified from four different human cell lines and ~1,600 proteins showed significant regulation upon drug treatment. Gene ontology and pathway/network analysis revealed common and cell type specific regulatory effects with strong connections to unfolded protein binding and protein kinase activity. Of the 288 identified protein kinases, 98 were downregulated (e.g. EGFR, BTK) and 17 up-regulated (e.g. AURA, AXL), in response to GA treatment, almost half of which are formerly unknown HSP90 client kinases. Furthermore pulsed-SILAC results suggested that protein down-regulation by HSP90 inhibition correlates with protein half life in many cases. Protein kinases show significantly shorter half lives than other proteins highlighting both challenges and opportunities for HSP90 inhibition in cancer therapy. The highly similar proteomic responses to the HSP90 drugs GA and PU-H71 suggest that both drugs work by similar molecular mechanisms. Several kinases (AXL, DDR1, TRIO) and other signaling proteins (BIRC6, ISG15, FLII) are validated as novel clients of HSP90 using HSP90 immunoprecipitation and affinity-based purification. Taken together, the strategy employed in this study is generic and therefore also of more general utility for the identification of novel drug targets and molecular pathway markers in tumors and broadly definition of the cellular proteome response to HSP90 inhibition provides a rich resource for further investigation relevant for the treatment of cancer.
Übersetzte Kurzfassung:
Proteinkinasen gehören zu den am besten erforschten Molekülen der zellulären Signaltransduktion und spielen sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen, beispielsweise im Krebsgeschehen, eine entscheidende Rolle. Heutzutage sind zahlreiche aberrante Kinasen in fast allen Stadien der Tumorentstehung beschrieben. Die gezielte, Kinasen-zentrierte Untersuchung des Krebsgeschehens bietet daher das Potential, neue Erkenntnisse mit therapeutischem Potential zu gewinnen. In der vorliegenden Studie wurde ein Proteom-weiter, auf quantitativer Massenspektrometrie basierender Kinase-Assay (kinobead) etabliert und optimiert. Dieser Assay ermöglicht die parallele Identifizierung und Quantifizierung von etwa 150 Kinasen bei 4% technischer und 8% biologischer Varianz.
Mithilfe dieses Assay wurden 34 Zelllinien von Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereichs (engl. head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC) untersucht. Von den 146 quantifizierten Kinasen wiesen 42 Kinasen statistisch signifikante (p<0.05) Expressionsunterschiede zwischen den Zelllinien auf. Darauf aufbauende RNA-Interferenz-Experimente in niedrig- und hoch-exprimierenden Zelllinien identifizierten eine Reihe von Kinasen, u. a. EGFR, EPHA2, LYN, JAK1, WEE1 und NEK9, die am Überleben bzw. der Proliferation der Krebszellen beteiligt sind. Während EGFR als bekanntes Zielprotein für Arzneimittel (engl. drug target) bestätigt werden konnte, wurde mit EPHA2 ein neues drug target identifiziert. 20% bzw. 15% der HNSCC-Zelllinien werden durch EGFR und EPHA2 angetrieben. Immunhistochemische Untersuchungen konnten dies bestätigen und zeigen, dass EGFR und EPHA2 in einigen der untersuchten HNSCC-Geweben stark exprimiert werden. Die Analyse der nachgeschalteten Signaltransduktionswege deutet an, dass EPHA2 die Zellproliferation über die Aktivierung von AKT und des ERK-Signaltransduktionsweges einleitet. Darüberhinaus sind mehrere der signifikant regulierten Kinasen potentielle Wirkorte des zugelassenen Wirkstoffs Dasatinib, der Kinasen der SRC-Familie inhibiert und das Wachstum einiger, jedoch nicht aller HNSCC-Zelllinien verhindert. Zusammengenommen könnten diese Erkenntnisse neue therapeutischen Optionen für HNSCC-Patienten eröffnen und letztlich zu einer rationaleren und besser begründeten Krebsdiagnose und individualisierten Therapie führen.
In einer zweiten Studie wurde der Kinobeads-Assay zusammen mit der globalen Analyse des Proteoms dazu verwendet, das HSP90-abhängige Proteom zu untersuchen, das bekanntermaßen insbesondere Proteine der Signaltransduktion und eine Vielzahl an Kinasen umfasst. Die Proteome-weiten Auswirkungen der Inhibierung von HSP90 wurden mithilfe des SILAC (engl. stable isotope labeling with amino acids in cell culture)-Ansatzes und quantitativer Massenspektromentrie analysiert. Dabei konnten mehr als 6200 Proteine in vier verschiedenen humanen Zelllinien identifiziert werden, und etwa 1600 davon wiesen signifikante Regulation nach HSP90-Inhibierung durch Geldanamycin (GA) auf. Bioinformatische gene ontology-Analysen und Untersuchungen von SIgnaltransduktionswegen und –netzwerken konnten sowohl allgemeine als auch Zelltyp-spezifische regulatorische Effekte mit starker Assoziation zu den Proteinfunktionen „Bindung ungefalteter Proteine“ und „Proteinkinase-Aktivität“ aufdecken. Von den 288 identifizierten Proteinkinasen wurden 98 nach Stimulus herunterreguliert (z. B. EGFR, BTK) und 17 hoch-reguliert (z. B. AURA, AXL), wobei fast die Hälfte der Kinasen bis dato nicht als HSP90-Klienten bekannt waren. Mithilfe eines pulsed-SILAC-Experiments konnte darüberhinaus gezeigt werden, dass die Herunterregulierung durch Inhibierung von HSP90 in vielen Fällen mit der Lebensdauer der Proteine korreliert. Dass insbesondere Proteinkinasen im Vergleich zu anderen Proteinen eine signifikant verringerte Lebensdauer aufweisen, hebt die besonderen Schwierigkeiten, aber auch Chancen der HSP90-Inhibierung für die Krebstherapie hervor. Interessanterweise sind die Proteom-weiten Auswirkungen der beiden HSP90-Inhibitoren GA und PU-H71 sehr ähnlich, was auf einen ähnlichen molekularen Mechanismus beider Wirkstoffe hindeutet. Mehrere Kinasen (AXL, DDR1, TRIO) und andere Signalproteine (BIRC6, ISG15, FLII) konnten als neue HSP90-Klienten über Immunopräzipitation und Affinitäts-basierte Aufreinigungen validiert werden.
Insgesamt ist die angewandte Strategie generisch ausgelegt und allgemein nützlich für die Identifikation von neuen drug targets und molekularen Signaltransduktionsmarkern in Tumoren. Darüberhinaus bietet die gewonnenen Daten der Proteom-weiten Antwort auf die Inhibierung von HSP90 eine ergiebige Resource für weitere Untersuchungen für die Behandlung von Tumoren.
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