Die klassischen Methoden zur Strukturaufklärung sind auf Proteine limitiert, die in relativ großen Mengen nativ exprimierbar und robust gegenüber biochemischen Reinigungsprozeduren sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Kombination aus in vitro Proteinsynthese und Kryo-Elektronentomographie die funktionelle und strukturelle Analyse von Proteinkomplexen in einer quasi nativen Umgebung ermöglicht. Die entwickelte Strategie erlaubt die schnelle Bereitstellung von 3D Kryo-EM-Strukturen mit moderater Auflösung, bei der die aufwändige Reinigung der Proteine vermieden wird. Dafür wurden Lysate nach der Expression des Zielproteins vitrifiziert und tomographiert. Für die Strukturbestimmung des 20S Proteasoms aus M. mazei wurden die Partikel mit Hilfe eines Mustererkennungsalgorithmus anhand ihrer strukturellen Signatur lokalisiert und anschließend 3D gemittelt. Die etablierte Methode wurde zur strukturellen Analyse eines Multienzymkomplexes aus T. acidophilum angewendet.
Translated abstract:
The classical methods for protein structure determination are limited to highly expressible and correctly folding proteins which must be robust to withstand biochemical purification procedures. In this study a combination of in vitro protein synthesis and cryo-electron tomography has been explored as a means for the functional and structural analysis of protein complexes in a more close to native state. The established strategy uses expedited means to provide 3D cryo-electron density maps of modest resolution without protein purification. Upon in vitro expression of the proteins, the corresponding lysates were vitrified and tomograms were acquired. For structure determination of the 20S proteasome of M. mazei, the particles were detected based on their structural signature using a pattern recognition algorithm and subjected to 3D averaging. The established method was applied to structural analysis of a multienzyme complex of T. acidophilum.
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