This thesis is based on the studies that have been carried out in the Department of Structural Research at the Max Planck Institute for Biochemistry from December 2000 to January 2004. Two projects were undertaken. The first was the study of function and interactions of cell cycle proteins and cell differentiation proteins. The proteins studied were retinoblastoma protein (pRb), cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) and cell differentiation factors MyoD and Id-2. The second project focused on structural and dynamic investigations on photoactive proteins green fluorescent protein (GFP), cyan fluorescent protein (CFP) and alpha subunit of phycoerythrocyanin (α-PEC). Cell growth and differentiation require precise interplay between cell cycle and differentiation factors. Because much of the data about the interactions between proteins crucial for this interplay is contradictory, the aim of the study was to find whether pivotal cell cycle proteins (pRb, and CDK6) can interact directly with myogenic differentiation promoting (MyoD) and inhibiting (Id–2) factors. These potential interactions were tested with pull down assays, gel filtration, mass spectroscopy, and the nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. We found that there are no direct protein–protein interactions in vitro. Indirect modulation of gene expression level of these proteins is therefore proposed. In addition we have also shown that the C–terminal part of human and chicken MyoD does not interact with human cycline-dependent kinase 6, contrary to the recent report about such a interaction taking place. The NMR characterization of the GFP and CFP created an opportunity for investigation of their dynamic properties. Newly adopted method of in vitro protein production allowed us to make 15N–His labeled samples of GFP without any cross–labeling to other amino acids. This probe allowed for identification of peaks corresponding to the important residues that interact with the chromophore (e.g. His148). The 15N - HSQC NMR spectra of the H148G GFP mutant and selectively labeled histidine samples indicated the presence of two conformations of the protein in slow exchange on the NMR time scale. Also the 19F NMR studies of variants of GFP and CFP labeled with fluorinated tryptophans, supported by temperature-, concentration- and folding-dependent experiments, provided direct evidence for the existence of a slow exchange process between two different conformational states of CFP. Photoisomerization of holoprotein α–PEC involves E – Z isomerization around a double bond in the chromophore. In our research we could observe how the two states of the chromophore influence the structure of protein. Using 15N – HSQC we observed double peaks that indicate existence of both E and Z conformations in α–PEC in the 566 nm form (made by 500 nm light irradiation). Moreover our experimental data suggest that the E form (induced by 577 nm irradiation) is conformationally unstable. Both the E and Z forms have some degree of inhomogenety with respect to the conformation of the protein. We found additionally that the E form undergoes dynamic changes in protein conformation due to interconversion to the Z form, even in darkness. This process does not affect UV/VIS spectroscopic properties of form E but it certainly affects the structure of the protein.     «

This thesis is based on the studies that have been carried out in the Department of Structural Research at the Max Planck Institute for Biochemistry from December 2000 to January 2004. Two projects were undertaken. The first was the study of function and interactions of cell cycle proteins and cell differentiation proteins. The proteins studied were retinoblastoma protein (pRb), cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) and cell differentiation factors MyoD and Id-2. The second project focused on structu...     »

Die Arbeit basiert auf Untersuchungen, welche in der NMR-Gruppe der Abteilung für Strukturuntersuchungen am Max-Planck-Institut für Biochemie vom Dezember 2000 bis Januar 2004 durchgeführt wurden. Zwei Projekte wurden bearbeitet: (a) die Untersuchung von Funktions- und Interaktionsmustern von bedeutenden Zellzyklus- (retinoblastoma protein (pRb) und cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)) und Zelldifferenzierungs- (MyoD und Id-2) proteinen; (b) strukturelle und dynamische Untersuchungen an den photoaktiven Proteinen GFP (green flourescent protein), CFP (cyan flourescent protein) und α-PEC (alpha-Untereinheit von Phycoerythrocyanin). Zellwachstum und Differenzierung erfordern ein präzises Zusammenspiel zwischen Zellzyklus- und Differenzierungsfaktoren. Da es eine Menge sich widersprechender Daten zur Wechselwirkung zwischen den für dieses Zusammenspiel entscheidenden Proteinen gibt, war das Ziel der Untersuchung, herauszufinden, ob die Zellzyklusproteine (pRb und CDK6) eine direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen mit den myogenischen differenzierungsfördernden (MyoD) bzw. hemmenden (Id-2) Faktoren haben. Wir untersuchten diese Möglichkeiten unter Verwendung von „Pull-Down“-Experimenten, Gel-Filtration, Massenspektroskopie, und kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR). Wir fanden heraus, dass es in vitro keine direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen gibt. Weiterhin haben wir gezeigt, dass die C-terminale Domäne von humanem und Hühner-MyoD nicht mit humanem CDK6 wechselwirkt. Die Charakterisierung von GFP und CFP mit NMR eröffnete die Möglichkeit für Untersuchungen ihrer dynamischen Eigenschaften. Die neu eingeführte Methode der in vitro-Proteinproduktion erlaubte uns, 15N-Histidin markierte Proben von GFP herzustellen, die frei von Kreuzmarkierungen durch andere Aminosäuren waren wie sie bei der in vivo Markierung vorkommen. Mit diesen Proben konnten die Peaks ermittelt werden, die für die Wechselwirkung mit dem Chromophor wichtig sind (z.B. His148). Die 15N-HSQC NMR-Spektren der H148G GFP-Mutant, die selektiv 15N-Histidin markiert war, deuten auf die Präsenz von zwei Konformationen des Proteins, in einem langsamen gegenseitigen Austausch auf der NMR-Zeitskala, hin. Die 19F-NMR-Studien mit Varianten von GFP und CFP, die mit fluorierten Tryptophanen markiert wurden lieferten, unterstützt durch temperatur-, konzentrations- und faltungsabhängige Experimente, direkte Hinweise auf die Existenz eines langsamen Austauschprozesses zwischen zwei verschiedenen konformativen Zuständen des CFP. Die Photoisomerisierung des Holoproteins α-PEC beinhaltet eine E-Z- Isomerisierung an einer Doppelbindung im Chromophor. Während unserer Untersuchungen konnten wir beobachten, wie die verschiedenen Zustände des Chromophors die Struktur des Proteins beeinflussen. In 15N-HSQC Experimenten konnten wir Doppel-Peaks beobachten, welche die Existenz beider Konformationen E und Z in α-PEC in der 566 nm Form zeigt. (Die 566 nm Form entsteht durch Belichten des Proteins mit einer Wellenlänge von 500 nm) Weiterhin weisen unsere experimentellen Daten auf eine konformative Instabilität der E-Form hin die bei Bestrahlung mit einer Wellenlänge von 577 nm entsteht. Es könnte sein, dass sowohl die E- als auch die Z-Form einen gewissen Grad an Inhomogenität bzgl. der Konformation des Proteins besitzen. Darüber geht die E-Form in einer dynamischen Veränderung aufgrund von Interkonversion in die Z-Form über. Dieser Prozess beeinflusst nicht die UV/VIS-spektroskopischen Eigenschaften der E-Form, aber er beeinflusst mit Sicherheit die Struktur des Proteins.     «

Die Arbeit basiert auf Untersuchungen, welche in der NMR-Gruppe der Abteilung für Strukturuntersuchungen am Max-Planck-Institut für Biochemie vom Dezember 2000 bis Januar 2004 durchgeführt wurden. Zwei Projekte wurden bearbeitet: (a) die Untersuchung von Funktions- und Interaktionsmustern von bedeutenden Zellzyklus- (retinoblastoma protein (pRb) und cyclin-dependent kinase 6 (CDK6)) und Zelldifferenzierungs- (MyoD und Id-2) proteinen; (b) strukturelle und dynamische Untersuchungen an den photoa...     »