Die vorgelegte Arbeit beschreibt den Einfluss von RNA-Struktur-Determinanten auf die heterologe bakterielle Gen-Expression. Heterologe Proteinsynthese ist in den letzten Jahren eine der wichtigsten Methoden in der Biotechnologie geworden. Nachdem die Genome der unterschiedlichsten Organismen sequenziert worden sind, ist die Expression der Gene, und damit die Synthese der jeweiligen Proteine zur Erforschung ihrer Strukturen und Funktionen für zukünftiges Verständnis molekularbiologischer und biochemischer Zusammenhänge von immenser Wichtigkeit. In diesem Zusammenhang sind die technologischen Ansprüche auf Hochdurchsatzverfahren, sowie die biotechnologische Produktion pharmazeutischer Wirkstoffe, wie z.B. die rekombinante Insulin-Produktion, konzentriert. Die Überexpression rekombinanter Proteine hängt von verschiedenen Faktoren ab, für die viele Strategien zur Steigerung entwickelt wurden. Der entscheidende Schritt bei der bakteriellen Translation ist die Ausbildung des Pre-Initiationskomplexes. Seine Ausbildung erfordert erste Kontakte zwischen mRNA, Initiator-tRNA und der 30S-Untereinheit des Ribosoms, wodurch die Initiation der Translation limitiert wird. In diesem Kontext beschreibt die Arbeit die Expression einiger als Wildtyp-Varianten nicht exprimierbarer Gene. Die Translationsinitiation dieser Gene wurde optimiert, indem ein synthetischer RNA-Stem-Loop (7bp stem length; DG0 = - 9,9 kcal/mol) 15 Nukleotide abwärts vom Start-Kodon vor den Gen-Sequenzen platziert wurde. Die Einführung der RNA-Sekundärstruktur ermöglichte die in vitro Expression von fünf vorher nicht exprimierbaren Genen und verbesserte die Expression bei allen weiteren untersuchten Genen. Die RNA-Strukturuntersuchungen zeigten die Ausbildung des RNA-Stem-Loops im Gen-Kontext. Ferner zeigten sie, dass das Einbringen des RNA-Stem-Loops zur Stabilisierung der Ribosomenbindestelle führte. Die theoretische RNA-Strukturberechnung zeigte die Fähigkeit des eingebrachten RNA-Stem-Loops Abwärtspaarungen der Ribosomenbindestelle und des Start-Kodons mit gen-spezifischen mRNA Sequenzen zu unterdrücken. Folglich stabilisierte das Einbringen des RNA-Stem-Loops die Ausbildung einer separaten Translationsinitiationsdomäne, die für die Ribosomen zur Initiation gut zugänglich ist. Ferner wurde untersucht, inwieweit die erfolgreiche Expression der schwer exprimierbaren Gene von der Stabilität und der Größe des RNA-Stem-Loops abhängt. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass der Expressionserfolg unter Einsatz kürzerer RNA-Stem-Loops (2 bis 6 bp Stammlänge) stark vom Gen abhängt, wobei bei Verwendung des 7bp-Stem-Loops bei allen untersuchten Genen die höchsten Expressionsergebnisse detektiert wurden. Neben diesen Untersuchungen wurde der Einfluss RNA-strukturschwächender Reagenzien auf die in vitro Proteinexpression untersucht.
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Die vorgelegte Arbeit beschreibt den Einfluss von RNA-Struktur-Determinanten auf die heterologe bakterielle Gen-Expression. Heterologe Proteinsynthese ist in den letzten Jahren eine der wichtigsten Methoden in der Biotechnologie geworden. Nachdem die Genome der unterschiedlichsten Organismen sequenziert worden sind, ist die Expression der Gene, und damit die Synthese der jeweiligen Proteine zur Erforschung ihrer Strukturen und Funktionen für zukünftiges Verständnis molekularbiologischer und bioc...
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