Although the in vitro maturation is an established technique for assisted reproduction, a lack of detailed information about intercellular communication between the oocyte and the surrounding somatic cells is still present. Additionally, differing results between various species demand their critical interpretation. Therefore, a lot of effort has been made to determine the important systems participating in this fundamental signalling process. It has been recognized that the intercellular communication plays a crucial role in the timing of the right events necessary to produce fertilizable oocytes and to coordinate embryo genesis. Therefore, the aim of this study is to evaluate the communication systems during the artificial maturation of bovine cumulus oocyte complexes (COC) which represents the key to optimal development. Additionally, these results were compared to those from cultivated bovine granulosa cells (GC). The investigations on the two related cell culture systems were done by using the sensitive real-time RT-PCR to detect minimal alterations in mRNA levels. Enzyme immuno assay (EIA) as well as radio immuno assay (RIA) were employed to measure specificly hormone and protein concentrations in the culture media. Additionally, to support mRNA data immunohistological techniques were used to detect protein localization in the tissue. In the present study it could be shown that maturing COC posses the ability to produce steroid hormones independently of the natural follicular environment. Furthermore, it could be proven that the environmental pollutant tributyltin (TBT) is able to interfere with the steroidogenic systems of both the maturing COC and the cultured GC which underwent luteinization during cultivation. A distinct dose dependant effect of TBT on estradiol-17b as well as progesterone synthesis could be demonstrated. A set of different connexins, important cellular channel proteins, could be detected by mRNA analysis showing dependency on the maturational status of the COC. In addition to this direct transmembrane communication by gap junctions, two isoforms of nitric oxide synthases (NOS), the inducible and the endothelial NOS, could be found which produce the small inorganic signal molecule nitric oxide (NO). Both enzymes were varied in COC and GC, respectively. A direct influence of the two gonadotropins FSH and LH on the mRNA levels of the NOS could be displayed in cultured GC. As indicators for the active participation of the oocyte in the regulation of cellular behavior of the surrounding somatic cells, the presence of the mRNA of two different oocyte derived factors, the growth and differentiation factor-9 (GDF-9) and the bone morphogenetic protein-15 (BMP-15), could be proven. Additionally, it was possible to sequence almost the whole mRNA of the bovine GDF-9, which was introduced into an E. coli expression system. Unfortunately the resulting recombinant protein of the mature growth factor did not show bioactivity as described in literature. However, with the existence of three potential GDF-9/BMP receptors (BMPR-1A, BMPR-1B and BMPR-2) in COC, GC and theca interna cells (TIC) respectively a functional follicular GDF-9/BMP-system can be assumed. Furhtermore, the extra cellular matrix (ECM) was subject to dramatic alterations during maturation. It could be demonstrated by histochemistry that the gel-like matrix surrounding the oocyte consists of hyaluronan (HA) which was possibly the product of the highly expressed HA synthase 2 (HAS2). The importance of the ECM could be proved by the coexistence of the two HA receptors CD44 and RHAMM (receptor for HA-mediated motility). Protecting the oocyte from mechanical forces, the HA rich matrix could also serve as a reservoir for diverse growth factors, able to bind to the ECM. One such member is the vascular endothelial growth factor (VEGF), which could be detected enriched in the ooplasm, in the Zona pellucida as well as in the follicular fluid. Its supplementation to the maturation medium significantly influenced the subsequent development of bovine embryos. In summary, a very complex system of diverse cellular communication systems could be detected, pointing out that all these systems would possibly interfere with each other which indicates their importance for the optimal development of the oocyte. Furthermore, a distinct local steroidogenic system could possibly proof suitable screening for endocrine disrupting agents.     «

Although the in vitro maturation is an established technique for assisted reproduction, a lack of detailed information about intercellular communication between the oocyte and the surrounding somatic cells is still present. Additionally, differing results between various species demand their critical interpretation. Therefore, a lot of effort has been made to determine the important systems participating in this fundamental signalling process. It has been recognized that the intercellular commun...     »

Im Rahmen der künstlichen Reproduktion nimmt die in vitro Reifung eine etablierte Rolle ein, doch fehlen immer noch Detailinformationen über die zelluläre Kommunikation zwischen der Eizelle und den umliegenden somatischen Zellen. Des weiteren erfordern die abweichenden Ergebnisse zwischen verschiedenen Spezies deren kritische Betrachtungsweise. Aus diesem Grund wird mit Nachdruck an der Aufklärung wichtiger Signalprozesse geforscht. Es wurde erkannt, dass die interzelluläre Kommunikation offensichtlich eine wichtige Rolle in der zeitlichen Koordination diverser Prozesse spielt, welche für die Generierung einer befruchtungsfähigen Eizelle und die Embryonalentwicklung erforderlich sind. Deshalb war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die verschiedensten Kommunikationswege während der künstlichen Reifung boviner Kumulus-Oocyten-Komplexe (COC) zu untersuchen, da diese den Grundstein der weiteren Entwicklung darstellen. Des weiteren wurden die gewonnen Erkenntnisse mit den Ergebnissen von kultivierten bovinen Granulosazellkulturen (GC) verglichen. Die Auswertung der genannten Zellkultursysteme erfolgte mittels der sensitiven Real-time PCR, welche auch geringste Abweichungen der spezifischen mRNA-Gehalte zu detektieren erlaubt. Zum spezifischen Nachweis von Hormonen und Proteinen in den Kulturmedien kamen sowohl der Enzym-Immuno-Assay (EIA) als auch der Radio-Immuno-Assay (RIA) zum Einsatz. Zur Bestätigung der mRNA-Ergebnisse wurden immunhistologische Techniken verwendet, um die Lokalisation der Proteine im Gewebe zu belegen. In der vorliegenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass die reifenden COC unabhängig vom intakten Follikel Steroidhormone produzieren können. Des weiteren konnte ein direkter Einfluß des Umwelttoxins Tributylzinn (TBT) auf die Steroidsynthese der reifenden COC als auch die der luteinisierenden GC-Kulturen nachgewiesen werden. Hierbei war ein dosisabhängiger Einfluß des TBTs sowohl auf die Östradiol-17b- als auch auf die Progesteron-Synthese zu verzeichnen. Die Existenz einer Reihe von Connexinen, wichtige zelluläre Verbindungsproteine, konnte auf Basis von mRNA-Daten belegt werden, die zum Teil eine eindeutige Abhängigkeit vom Reifestatus der COC zeigten. Neben der transmembranen Kommunikation via Gap Junctions, war es ebenfalls möglich zwei Stickoxidsynthasen (NOS), die induzierbare und die endotheliale NOS, zu detektieren, welche das membrangängige anorganische Signalmolekül Stickoxid (NO) produzieren. Beide Isoformen dieser Enzymfamilie wiesen eine unterschiedliche Regulation in den COC im Vergleich zu den kultivierten GCs auf. Ebenso konnte ein direkter Einfluß der Gonadotropine FSH und LH auf die mRNA-Expression in den GC-Kulturen nachgewiesen werden. Die aktive Teilnahme der Eizelle an der Regulation von Zellfunktionen der umliegenden somatischen Zellen konnte durch das Vorhandensein spezifischer mRNA-Transkripte des Wachstums- und Differenzierungsfaktors-9 (GDF-9) und des Knochenwachstumsproteins-15 (BMP-15) in der Eizelle belegt werden. Obendrein war es möglich nahezu die vollständige bovine mRNA-Sequenz von GDF-9 zu entschlüsseln, welche im Anschluß als Basis eines E. coli-Expressionssystems diente. Zunächst zeigte aber das rekombinante Protein des nativen Wachstumsfaktors nicht die beschriebene Bioaktivität. Aber die Anwesenheit von drei potentiellen GDF-9/BMP-Rezeptoren (BMPR-1A, BMPR-1B und BMPR-2) sowohl in COC, GC als auch in Zellen der Theka interna läßt auf ein funktionelles GDF-9/BMP-System in bovinen Ovarfollikeln schließen. Des Weiteren obliegt auch die Extrazelluläre Matrix (ECM) einer massiven Umgestaltung. Mittels histochemischer Methoden konnte gezeigt werden, daß die gelartige Matrix um die Eizelle zum Großteil aus Hyaluronsäure (HA) besteht, die möglicherweise als Syntheseprodukt der hoch-expremierten HA-Synthase-2 (HAS2) anzusehen ist. Die Wichtigkeit der ECM wird durch die Co-Existenz der beiden HA-Rezeptoren CD44 und RHAMM (Rezeptor für HA-vermittelte Bewegungen) unterstrichen. Neben dem Schutz vor mechanischer Belastung der Eizelle dient diese HA-reiche Matrix möglicherweise auch als Bioreservoir für diverse Wachstumsfaktoren, welche eine hohe ECM-Affinität aufweisen. Hierzu zählt unter anderem der endotheliale vaskuläre Wachstumsfaktor (VEGF), welcher in hohem Maße im Ooplasma, in der Zona pellucida als auch in der Follikelflüssigkeit angereichert war. Seine Supplementierung zum Reifungsmedium hatte einen signifikanten Einfluß auf die nachfolgende bovine Blastocysten-Entwicklung. Zusammenfassend kann man sagen, daß eine Vielzahl wichtiger zellulärer Kommunikations-systeme nachgewiesen werden konnte. Des weiteren bestehen mögliche Interaktionen zwischen diesen Systemen, denen eine fundamentale Rolle bei der Eizell-Entwicklung zugeschrieben wird. Das lokale Steroidogenese-System dieser Zellkultursysteme könnte möglicherweise auch als Testverfahren für „endokrin entkoppelnde“ Substanzen herangezogen werden.     «

Im Rahmen der künstlichen Reproduktion nimmt die in vitro Reifung eine etablierte Rolle ein, doch fehlen immer noch Detailinformationen über die zelluläre Kommunikation zwischen der Eizelle und den umliegenden somatischen Zellen. Des weiteren erfordern die abweichenden Ergebnisse zwischen verschiedenen Spezies deren kritische Betrachtungsweise. Aus diesem Grund wird mit Nachdruck an der Aufklärung wichtiger Signalprozesse geforscht. Es wurde erkannt, dass die interzelluläre Kommunikation offensi...     »