4-Hydroxyphenylpyruvat Dioxygenase (HPPD) ist ein ubiquitär verbreitetes Enzym, das eine wichtige Rolle beim Abbau aromatischer Aminosäuren spielt und in Pflanzen am Prenylchinonsyntheseweg beteiligt ist. Das Enzym zählt zu den mononuklearen Nicht-Häm-Eisen Proteinen, deren Aktivität von einer α-Ketosäure abhängig ist. In dieser Klasse stellt die HPPD jedoch einen eigenständigen Vertreter dar, weil sie im Unterschied zu weiteren α-Ketosäure abhängigen Enzymen beide Sauerstoffatome in ein einziges Substrat einbaut. Der benötigte Cofaktor liegt hier bereits als integraler Bestandteil des Substrates vor, während andere Enzyme dieser Klasse in der Regel α-Ketoglutarat oxidieren, das anschließend zu Succinat decarboxyliert wird. HPPD katalysiert die oxidative Decarboxylierung der Seitenkette von 4-Hydroxyphenylpyruvat, die von einer Hydroxylierung des aromatischen Rings und einer 1,2-Umlagerung der Carboxymethylgruppe begleitet wird. Das Reaktionsprodukt Homogentisat wird im Aminosäurekatabolismus weiter zu Fumarat und Acetoacetat abgebaut. In Pflanzen dient Homogentisat als Vorstufe für die Plastochinon- und Tocopherolsynthese. Das HPPD-Gen aus Zea mays wurde kloniert, heterolog in E. coli unter stringenten Bedingungen exprimiert, gereinigt, kristallisiert und die Struktur des Enzyms (zmHPPD) bei einer Auflösung von 2 Å unter Verwendung der Methode des Single Isomorphous Replacement (SIR) gelöst. Diese Struktur ermöglichte mittels Molekularem Ersatz die Kristallstruktur der HPPD aus Arabidopsis thaliana (atHPPD) bei einer Auflösung von 3 Å aufzuklären. Die in dieser Arbeit ermittelten Strukturen sind die ersten Kristallstrukturen des Enzyms aus eukaryotischen Organismen. Die dimere Organisation unterschiedlicher eukaryotischer HPPDs, die bereits früher durch biochemische Charakterisierungen bestimmt wurde, konnte dabei erstmals auf struktureller Basis bestätigt werden. Jedes Monomer wird durch zwei strukturelle Domänen aufgebaut, deren Faltungsmotive denen der 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase und Catechol 2,3-Dioxygenase ähneln, obwohl diese zur Klasse der extradiol ringspaltenden Dioxygenasen zählen. Wie anhand der Sequenzhomologie zu erwarten war, weist der dreidimensionale Aufbau der Monomere große Ähnlichkeit zu dem der HPPD aus Pseudomonas fluorescens auf. Im Unterschied zum bakteriellen Enzym sind jedoch andere Strukturbereiche an der Dimerisierung beteiligt. Insertionen von Aminosäuren, besonders in der N-terminalen Sequenz, die durch früher durchgeführte Sequenzvergleiche nicht als solche erkannt worden waren, sind an der Bildung der Dimerkontakte beteiligt. Die pflanzlichen Enzymstrukturen zeigen, daß die C-terminale Helix als flexible Schranke den Zugang zum aktiven Zentrum regulieren kann, indem eine Rotation um Asn416 (zmHPPD) erfolgt. Die Architektur des aktiven Zentrums ist konserviert, was die sterischen Erfordernisse für die Katalyse der mehrere Schritte umfassenden Reaktion widerspiegelt. Das Eisenatom im aktiven Zentrum wird in HPPD durch zwei Histidin- und einen Glutamatrest koordiniert, wobei in zmHPPD dessen oktaedrische Koordination nachgewiesen werden konnte. Die lösliche anorganische Pyrophosphatase (PPase) aus Heliothis virescens wurde kristallisiert und das Atommodell bei einer Auflösung von 2,1 Å verfeinert, die Struktur wurde durch Molekularen Ersatz mit Hefe PPase als Suchmodell gelöst. Dieses Enzym ist zur Kontrolle der intrazellulären Pyrophosphatkonzentration wichtig, weil anorganisches Pyrophosphat bei vielen Biosynthesereaktionen freigesetzt wird. Dessen Hydrolyse durch PPase treibt diese Reaktionen thermodynamisch an und macht sie irreversibel. Zur Katalyse benötigt das Enzym divalente Metallcofaktoren. Die Kernstruktur des dimer organisierten Enzyms besteht aus einem verdrehten β-Barrel, welches von α-Helices umgeben ist und das aktive Zentrum enthält. Dieses befindet sich in einer Vertiefung von etwa 20 Å Durchmesser. Wie in den Strukturen des Enzyms aus E. coli und S. cerevisiae konnte gezeigt werden, daß die Bindung von zwei Mg2+-Ionen bereits vor der Substratbindung erfolgt.
Translated abstract:
4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) is an ubiquitous enzyme which plays an important role in the degradation of aromatic amino acids and participates in prenylquinone synthesis in plants. The enzyme belongs to the mononuclear non-heme-iron proteins whose activity depend on an α-keto acid as a cofactor. But in contrast to other enzymes of this class, HPPD catalyzes the incorporation of both atoms of molecular oxygen into a single substrate, as the cofactor is an integral part of it, whereas the other enzymes normally oxidize α-ketoglutarate, which is afterwards decarboxylated to succinate. HPPD catalyzes the oxidative decarboxylation of the α-keto acid side chain of 4-hydroxyphenylpyruvate, accompanied by hydroxylation of the aromatic ring and 1,2-migration of the carboxymethyl group. The reaction product homogentisate is then further degraded to fumarate and acetoacetate in amino acid catabolism. In plants, homogentisate serves as a precursor for plastoquinone and tocopherol synthesis. The HPPD gene from Zea mays was cloned, the protein was expressed in E. coli under stringent conditions, purified and crystallized. The structure was solved at 2 Å resolution using Single Isomorphous Replacement (SIR). The structure of zmHPPD was used as a model to solve the structure of Arabidopsis thaliana HPPD by Molecular Replacement at 3 Å resolution. These are the first x-ray structures of HPPDs from eukaryotic organisms. The dimeric organisation of eukaryotic HPPDs which has already been shown by biochemical characterizations on enzymes of different organisms could be affirmed on structural basis. Each monomer consists of two structural domains whose motifs resemble that from 2,3-dihydroxybiphenyl 1,2-dioxygenase and catechol 2,3-dioxygenase, although these enzymes belong to the extradiol cleaving class of dioxygenases. Like expected from the sequence homology, the monomers of the plant HPPDs share the overall fold with the enzyme from Pseudomonas fluorescens. But unlike the bacterial enzyme, the plant HPPDs dimerizes in a complete different mode than the dimers which can be deduced from the tetrameric bacterial structure. Insertions of amino acids especially in the N-terminal half of the sequence which could not be identified as insertions in formerly arranged sequence alignments do participate in dimer building contacts. Comparison of both structures provides direct evidence that the C-terminal helix gates substrate access to the active site by a possible rotation around Asn416 (zmHPPD) that functions as a rigid pivot point. The active site architecture is remarkably well conserved which very likely reflects steric requirements for catalysis in the multi-step reaction, the iron atom is coordinated by two histidine and one glutamic acid residue in all HPPDs. Additionally, the structure of zmHPPD clearly shows an octahedral coordination sphere that is comprised of the three protein ligand atoms and three water molecules. Soluble inorganic pyrophosphatase (PPase) from Heliothis virescens was crystallized and the model refined at 2.1 Å resolution using the coordinates of yeast PPase as a model for Molecular Replacement. This enzyme plays an important role in the control of the intracellular pyrophosphate concentration as inorganic pyrophosphate is released during many biosynthetic reactions. Its hydrolysis, catalyzed by PPase, serves as thermodynamic driving force and makes those reactions irreversible. For catalytic activity, divalent metal ions are essential. The core structure of the eukaryotic dimeric enzyme consists of a twisted β-barrel which is surrounded by α-helices and harbours the active site. The reaction centre is localized in a cavity of 20 Å diameter. Like in the structures of PPase from E. coli and S. cerevisiae it could be shown that two Mg2+ ions are already bound in the active site prior to substrate binding.
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