In dieser Arbeit wurde, unter anderem, die Translokation von DNA-Hairpins durch eine alpha-hemolysin (aHL) Nanopore in einer Lipidmembran untersucht. Dafür wurde zunächst ein neuartiger Messaufbau entwickelt, bei welchem eine äußerst stabile Lipidmembran zwischen zwei mikroskopisch kleinen Wassertröpfchen, in einem Lipid-Öl-Bad, hergestellt wird (DIP, droplet interface bilayer). Dadurch konnte ein minimales Probenvolumen, bei einer äußerst stabilen Membran und geringem Rauschen, erreicht werden. Mit diesem Aufbau wurde entdeckt, dass die Inkorporationsrate von aHL und MspA exponentiell mit der angelegten Spannung steigt. Durch diesen Effekt kann die Inkorporation einer einzelnen Pore, über die angelegte Spannung, kontrolliert werden.  Die Translokation von DNA Molekülen durch einzelne Poren konnte, anhand der Blockade des Ionenstromflusses, detektiert werden. Gleichzeitig wurde die elektrophoretische Kraft, auf die geladene DNA, durch die angelegte Spannung kontrolliert. Da doppelsträngige DNA nicht durch die Engstelle in der Pore passt, werden DNA-Hairpins während der Translokation entfaltet. Mit der Nanoporenkraftspektroskopie (NFS) kann die spannungsabhängige Dauer dieser Entfaltung gemessen werden. In einer ersten Studie konnte gezeigt werden, dass ein DNA-Hairpin aus zehn Basenpaaren deutlich unstabiler ist, als ein G-Quadruplex aus acht Basen. In weiteren Untersuchungen wurden zwei DNA-Hairpins miteinander verglichen, welche dieselbe thermodynamische Stabilität besitzen, aber eine um den Faktor hundert unterschiedliche Translokationsdauer aufweisen. Mit Hilfe von Thermodynamischen Tabellen konnte die Energielandschaft der Hairpins berechnet werden, und dieser Unterschied durch das mesoskopische Modell erklärt werden. Durch die Einführung einer Anker-Technik konnten NFS Messungen auch in Rückwärts-Richtung durchgeführt werden, ohne den Eifluss des Vorhofs der aHL-Pore. Durch die Messung der Stabilität von 11 verschiedenen DNA-Hairpins, konnten die Vorhersagen der Translokationsdauer durch das mesoskopisches Modell bestätigt werden, und die dafür nötigen Fitparameter ermittelt werden. Dieses Modell kann nun für die Vorhersage der Stabilität beliebiger DNA-Hairpins verwendet werden, was eine wichtige Grundlage für weitere Experimente, mit komplizierteren DNA-Strukturen und Aptameren, darstellt.     «

In dieser Arbeit wurde, unter anderem, die Translokation von DNA-Hairpins durch eine alpha-hemolysin (aHL) Nanopore in einer Lipidmembran untersucht. Dafür wurde zunächst ein neuartiger Messaufbau entwickelt, bei welchem eine äußerst stabile Lipidmembran zwischen zwei mikroskopisch kleinen Wassertröpfchen, in einem Lipid-Öl-Bad, hergestellt wird (DIP, droplet interface bilayer). Dadurch konnte ein minimales Probenvolumen, bei einer äußerst stabilen Membran und geringem Rauschen, erreicht werden....     »

In this doctoral thesis, the translocation process of DNA hairpins through a alpha-hemolysin (aHL) nanopore was studied. For Incorporation of a single aHL pore into a lipid bilayer, a novel bilayer setup was developed. Therefor two aqueous microdroplets were brought into contact in a lipi-oil solution, forming a lipid bilayer between them. The bilayers formed with this setup are very stable and produce only little electrical noise in electrical bilayer recording. Also the volume consumption is very little. Using this setup, it was found that the incorporation rate of aHL and MspA is strongly dependent on the applied potential. This can be used to control the formation of a single channel, by applying an appropriate voltage. The translocation process of single DNA molecules can be detected through a blockage of the ionic current through the pore. Meanwhile the electrophoretic force on the negatively charged DNA can be controlled by the applied voltage. Double-stranded DNA can not translocate through the pore and DNA hairpins are unzipped during the translocation process. With nanopore force spectroscopy (NFS) the translocation duration is measured, which is voltage dependent. In first Experiments we have shown that a 10 base pairs DNA hairpin is less stable than a G-quadruplex formed of only eight bases. Also the stability of two hairpins with the same thermodynamic stability was compared. However the translocation duration differed by a factor of 100. Using thermodynamic tables, the unfolding energy landscape was calculated and the different translocation behaviour could be explained with a mesoscopic model. By developing an anchor technique, we have been able to perform experiments also in backward direction, without the influence of the pore vestibule. Measurements of 11 different hairpins showed a very good agreement with the predictions of the mesoscopic model. This model can now be used to predict the stability of arbitrary secondary structures, which is a good basis for the analysis of more complex structures or aptamers.     «

In this doctoral thesis, the translocation process of DNA hairpins through a alpha-hemolysin (aHL) nanopore was studied. For Incorporation of a single aHL pore into a lipid bilayer, a novel bilayer setup was developed. Therefor two aqueous microdroplets were brought into contact in a lipi-oil solution, forming a lipid bilayer between them. The bilayers formed with this setup are very stable and produce only little electrical noise in electrical bilayer recording. Also the volume consumption is...     »