Die Strukturaufklärung von makromolekularen Komplexen und Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung ist eine große Herausforderung der Strukturbiologie. Hervorragend zur Lösung dieser Aufgabe geeignet ist die Kryoelektronentomographie (KET), die es ermöglicht, subzelluläre Strukturen direkt in ihrer zellulären Umgebung abzubilden. Durch die zusätzliche Anwendung von Subtomogrammalignierung und -mittelung können Elektronendichten von Proteinkomplexen mit deutlich erhöhten Signal-Rausch-Verhältnissen rekonstruiert werden. Die gegenwärtig erreichbare Auflösung hängt jedoch deutlich von der Genauigkeit ab, mit der die Kontrasttransferfunktion (Contrast transfer function, CTF) des Mikroskops und die Modulationstransferfunktion (Modulation transfer function, MTF) des Detektors bestimmt und anschließend korrigiert werden können. Das vorrangige Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung einer Methode zur Korrektur dieser Transferfunktionen mit hoher Genauigkeit, um die Auflösungsbegrenzung der KET in Kombination mit Subtomogrammalignierung zu umgehen. Zur Bestimmung und Korrektur der CTF wurde ein neuer Ansatz entwickelt, der auf einem erweiterten Bildaufnahmeschema basiert. Dabei werden mit hoher Elektronendosis zwei zusätzliche Bilder aufgenommen, die diametral entlang der Kippachse räumlich entfernt von der Aufnahmestelle des Objekts, um Strahlenschaden zu vermeiden, platziert werden. Durch die hohe Elektronendosis wird das Signal dieser Bilder verstärkt, so dass die CTF extrahiert und der Defokus genau bestimmt werden kann. Diese Defokuswerte werden schließlich zur Interpolation des Defokus an der Aufnahmestelle und zur CTF Korrektur verwendet. Zusätzlich wurde die Korrektur der MTF in den Prozess der Subtomogrammalignierung eingebunden. Diese neue Methode verhindert, auf der Ebene der Subtomogramme, eine zu hohe Verstärkung des Rauschanteils. Zur Validierung der Methode wurde das Porin MspA von Mycobacterium smegmatis eingesetzt. Durch die Anwendung von KET und Subtomogrammalignierung auf MspA, rekonstituiert in Lipidvesikel, war es möglich, eine dreidimensionale Rekonstruktion des Porins in einer nahezu natürlichen Umgebung zu erhalten. Trotz seiner geringen Molekülmasse von 160 kDa und dem geringem Kontrastunterschied zwischen Protein und Lipidmembran wurde eine Auflösung von etwa 12 Å (Fourier-shell correlation nach dem 0.5 Kriterium) erzielt.     «

Die Strukturaufklärung von makromolekularen Komplexen und Membranproteinen in ihrer natürlichen Umgebung ist eine große Herausforderung der Strukturbiologie. Hervorragend zur Lösung dieser Aufgabe geeignet ist die Kryoelektronentomographie (KET), die es ermöglicht, subzelluläre Strukturen direkt in ihrer zellulären Umgebung abzubilden. Durch die zusätzliche Anwendung von Subtomogrammalignierung und -mittelung können Elektronendichten von Proteinkomplexen mit deutlich erhöhten Signal-Rausch-Verhä...    »