Immunoglobulin (Ig) gene conversion is one of three B cell specific processes which create the repertoire of antigen receptors in B cells. The process involves the unidirectional transfer of sequences from pseudogene V segments into the rearranged V gene. There are general and lymphoid-specific trans-acting factors as well as cis-acting elements involved in this process. Gene conversion is most likely initiated by AID mediated cytosine deamination. If the resulting uracils need to be further processed by uracil glycosylase (UNG), UNG inactivation should block gene conversion and induce transition mutations. We report in this thesis that is indeed the phenotype in the B cell line DT40. Ig gene conversion is almost completely extinguished in the UNG-/- mutant and large numbers of transition mutations at C/G bases accumulate within the rearranged Ig light chain gene. The mutation rate of UNG-/- cells is about seven times higher than of pseudo V gene deleted (pseudo V-) cells in which mutations arise presumably after uracil excision. In addition, UNG-/- cells show relatively more mutations upstream and downstream of the VJ segment. This suggests that hypermutating B cells process AID-induced uracils with approximately one seventh of uracils giving rise to mutations depending on their position. Besides gene conversion DT40 is also a good tool to analyze somatic hypermutation. Whereas in human and mice all of the nucleotides are target for mutations, in DT40 C/G bases are the main targets. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) coordinates DNA synthesis during replication. Mono-ubiquination of PCNA by RAD18 is induced by DNA damage and leads to the engagement of translesion DNA polymerases in S. cerevisiae. In this thesis we showed that RAD18 is sensitive to DNA damaging agents and somatic mutations are reduced in the absence of RAD18. The results demonstrate that PCNA ubiquitination by RAD18 as well as by some other factors in vertebrate cells are needed, most likely by recruitment of error-prone translesion polymerases.     «

Immunoglobulin (Ig) gene conversion is one of three B cell specific processes which create the repertoire of antigen receptors in B cells. The process involves the unidirectional transfer of sequences from pseudogene V segments into the rearranged V gene. There are general and lymphoid-specific trans-acting factors as well as cis-acting elements involved in this process. Gene conversion is most likely initiated by AID mediated cytosine deamination. If the resulting uracils need to be further pro...     »

Immunglobulin (Ig) Genkonversion ist einer der drei B-Zellspezifischen Prozesse, welche für die große Variabilität der Antigenrezeptoren in den B-Zellen verantwortlich sind. Maßgebend für den Prozess ist der unidirektionale Transfer von Sequenzen eines strangaufwärts gelegenen V-Segment-Pseudogens in das exprimierte, umgebaute V-Region-Gen. Der Prozess läuft unter der Beteiligung allgemeiner und lymphoid-spezifischer trans-wirkender Faktoren, sowie cis-wirkender Elemente ab. Genkonversion wird wahrscheinlich durch die AID-Vermittelte Desaminierung von Cytosin eingeleitet. Wird das resultierende Uracil im weiteren Verlauf durch Uracil Glykosylase (UNG) modifiziert, sollte die Inaktivierung von UNG die Genkonversion stoppen und Transition-Mutationen einführen. In dieser Doktorarbeit konnte nachgewiesen werden, dass in einer UNG-/- Mutante der B-Zelllinie DT40 die Genkonversion fast komplett zum Erliegen kommt und sich Transitionen an C/G Basen im umgebauten Ig Gen der leichten Kette häufen. Die Mutationsrate von UNG-/- Zellen ist ungefähr siebenmal höher als in Zellen mit einer Deletion der V-Pseudogene (pseudo V-), bei welchen Mutationen vermutlich nach dem Ausschneiden des Uracils auftreten. Darüber hinaus zeigen UNG-/- Zellen relativ mehr Mutationen stromaufwärts und stromabwärts des VJ-Segments. Das weist darauf hin, dass in Hypermutierenden B-Zellen etwa ein Siebtel des durch AID eingeführten Uracils in Abhängigkeit von seiner Position zu Mutationen führt. Neben der Genkonversion lässt sich in DT40 auch die somatische Hypermutation untersuchen. Während beim Menschen und in der Maus alle Nukleotide Ziel für Mutationen sind, werden in DT40 hauptsächlich C/G Basen mutiert. „Proliferating cell nuclear antigen“ (PCNA) koordiniert die DNA-Synthese während der Replikation. Mono-Ubiquitinierung von PCNA durch RAD18 wird durch Schädigung der DNA eingeleitet und führt zur Rekrutierung der Translesion DNA Polymerasen in S. cerevisiae. In der vorliegenden Arbeit haben wir gezeigt, dass RAD18 sensitiv für DNA schädigende Agenzien ist und somatische Mutationen in Abwesenheit von RAD18 abnehmen. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass die Ubiquitinierung von PCNA durch RAD18 und einige andere Faktoren in Zellen von Wirbeltieren für die somatische Hypermutation notwendig ist, wahrscheinlich weil es Error-Prone Translesion Polymerasen rekrutiert.     «

Immunglobulin (Ig) Genkonversion ist einer der drei B-Zellspezifischen Prozesse, welche für die große Variabilität der Antigenrezeptoren in den B-Zellen verantwortlich sind. Maßgebend für den Prozess ist der unidirektionale Transfer von Sequenzen eines strangaufwärts gelegenen V-Segment-Pseudogens in das exprimierte, umgebaute V-Region-Gen. Der Prozess läuft unter der Beteiligung allgemeiner und lymphoid-spezifischer trans-wirkender Faktoren, sowie cis-wirkender Elemente ab. Genkonversion wird w...     »