Identifizierung, funktionelle Charakterisierung und Gewebsverteilung des murinen hyperpolarisationsaktivierten zyklonukleotidgesteuerten Kationenkanals mHCN1
Übersetzter Titel:
Identification, functional Characterization and Tissue-Distribution of the murine Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Cation Channel mHCN1
1. Der h-Strom ( Ih) wurde seit ca. 20 Jahren an nativen Zellen eingehend untersucht und elektrophysiologisch charakterisiert. Bei Ih handelt es sich um einen durch Hyperpolarisation aktivierten kationischen Einwärtsstrom. Er wird durch direkte Bindung von cAMP an den zugrundeliegenden Kanal moduliert. Der Strom ist für viele wichtige Funktionen in kardialem und neuronalem Gewebe verantwortlich. Im Herzen ist er wesentlich an der Ausbildung des Schrittmacherpotentials im Sinusknoten und dessen Modulation durch sympathische und parasympathische Erregung beteiligt. In Neuronen trägt er zur Erregungsweiterleitung sowie zur Bestimmung und Stabilisierung des Membranruhepotentials bei. Außerdem agiert er als Schrittmacher in oszillierenden Neuronen des Thalamus und des Stratum oriens im Hippocampus. Trotz der ausführlichen Untersuchungen war die molekulare Struktur der Ih-Kanäle bis vor kurzem völlig unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine cDNA charakterisiert, die für den "murine hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 1" (mHCN1) codiert. Das Genprodukt weist alle wesentlichen Merkmale eines Ih-Kanals auf. 2. Die Primärstruktur von mHCN1 weist sechs Transmembransegmente (S1-S6), eine ionenleitende Pore zwischen S5 und S6 und eine Zyklonukleotidbindungstasche im Carboxyterminus auf. Das vierte Transmembransegment agiert vermutlich als Spannungssensor. Außerdem befindet sich im Carboxyterminus eine Polyglutaminregion, deren Funktion allerdings unbekannt ist. HCN1 bildet mit drei weiteren HCN-Kanälen (HCN2-4) eine neue Ionenkanalfamilie, die zur Superfamilie der spannungsabhängigen Kationenkanäle gehört. 3. Nach Expression in HEK293-Zellen konnte mHCN1 funktionell charakterisiert werden. mHCN1 vermittelt einen durch Hyperpolarisation ausgelösten Einwärtsstrom, der von Na+ und K+ getragen wird. Die Aktivierungsschwelle liegt bei -50 mV, die halbmaximale Aktivierung bei -77mV. Ab etwa -110 mV ist der Kanal voll aktiviert. Aktivierung und Ionenselektivität stimmen mit nativen Ih-Kanälen überein. 4. Der Zeitverlauf der Aktivierung läßt sich durch zwei Exponentialfunktionen annähern, deren Zeitkonstanten bei 30 und 171 ms liegen. Damit ist mHCN1 von allen bisher charakterisierten mHCN-Kanälen der am schnellsten aktivierende. cAMP bewirkt eine signifikante Verschiebung der Strom-Spannungskurve um 5 mV. 5. Die Expression von mHCN1,2 und 3 wurde untersucht. Durch Northern-Blot wurde gezeigt, dass alle drei Kanäle im Gehirn exprimiert werden, während im Herzen nur mHCN2 vorkommt. Dieser ist dort gleichmäßig in der gesamten Herzmuskulatur verteilt. Im Gehirn zeigen die drei Kanäle ein sehr unterschiedliches Expressionsmuster. mHCN1 kommt vor allem im Kleinhirn, im Hippocampus und im Cortex cerebri vor. mHCN2 wird dagegen nahezu ubiquitär auf sehr hohem Niveau exprimiert. mHCN3 kommt im Gehirn nur in extrem geringer Menge vor.
Übersetzte Kurzfassung:
1. The h-current (Ih) has been investigated and electrophysiologically characterized in native cells for about 20 years. Ih is a hyperpolarisation-activated cationic inward current. It is modulated by direct binding of cAMP to the related ion-channel. The current is responsible for many important functions in cardiac and neuronal tissue. In the heart it is essentially contributing to the creation of the pacemaker-potential in the SA-node and its modulation by sympathetic and parasympathetic excitation. In neurons it is contributing to the conductance of excitations as well as to the determination and stabilization of the membrane resting potential. Further it is serving as a pacemaker in oscillating neurons of the thalamus and stratum oriens of the hippocampus. In spite of these comprehensive investigations the molecular structure of Ih-channels was completely unknown until recently. Here a cDNA was identified which codes for the "murine hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel 1" (mHCN1). The protein exhibits all essential properties of an Ih-channel. 2. The primary structure of mHCN1 shows six membrane-spanning segments (S1-S6), an ion-conducting pore betweeen S5 and S6 and a cyclic nucleotide binding domain in the c-terminus. Further more in the c-terminus there is a polyglutamine-region, the function of which is unknown. Together with three more HCN-channels (HCN2-4) HCN1 is forming a new family of ion-channels belonging to the superfamily of voltage-gated cation-channels. 3. After expression in HEK293-cells mHCN1 was functionally characterized. mHCN1 carries a hyperpolarization-activated Na+ and K+ inward current. The activation threshold is -50 mV, the half-maximal value -77 mV. At about -110 mV the channel is fully activated. Activation and ion selectivity are matching the properties of native Ih-channels. 4. The rate of activation is well fitted by two exponentials with time constants of 30 and 171 ms, respectively. Thus mHCN1 is the fastest activating of all identified mHCN-channels. cAMP causes a significant shift of the activation curve by 5 mV. 5. The expression of mHCN1,2 and 3 was investigated. Northern-blot analysis revealed expression of all three channels in the brain, whereas in the heart only mHCN2 is found. It is evenly distributed in cardiac muscle. In the brain the three channels exhibit very distinctive patterns of expression. mHCN1 is found mainly in the cerebellum, the hippocampus and the cerebral cortex. mHCN2 is expressed almost ubiquitously at a very high level. mHCN3 is found in the brain only in extremly small amounts.
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