Immunglobulin A ist die häufigste Antikörperklasse in den Schleimhäuten sowie den Schleimhautsekreten des Menschen und wirkt dort als eine erste immunologische Verteidigungslinie gegen angreifende Mikroorganismen. Im humanen Serum ist IgA die zweithäufigste Antikörperklasse und bildet eine zweite Verteidigungsbarriere gegen Pathogene, die bereits die mukösen Oberflächen durchdrungen haben. Die IgA spezifische Immunantwort wie Phagozytose, ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity), Präsentation von Antigenen, Produktion reaktiver Sauerstoffmetabolite sowie die Freisetzung von Entzündungsmediatoren und Zytokinen wird dabei über die Wechselwirkung der IgA Antigen-Antikörper-Komplexe mit verschiedenen Effektorzellen ausgelöst. Diese Wechselwirkung wird durch die Bindung des Fc-Fragments des Antikörpers an Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche dieser Effektorzellen vermittelt. Der Fcα Rezeptor I ist der vorherrschende Fc-Rezeptor für alle Isotypen des Immunglobulin A im humanen Serum. In letzter Zeit ist das wissenschaftliche Interesse an IgA und dem zugehörigen Rezeptor FcαRI, aufgrund der effektiven Behandlungsmöglichkeiten von Krebs durch IgA Antikörper außerordentlich gestiegen. In in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass therapeutische Antikörper, durch die Bindung an FcαRI auf polymorphkernigen Neutrophilen, eine effiziente Lyse der Tumorzellen bewirken können. Innerhalb dieser Arbeit gelang es, dass extrazelluläre Fragment des humanen Fcα-Rezeptors I rekombinant in E.coli, in Form von inclusion bodies zu exprimieren, rückzufalten und zu reinigen. Das so erhaltene Protein besitzt, trotz der fehlenden Glykosylierung, die Fähigkeit humanes Immunglobulin A zu binden. Die Lagerung des Proteins bei 4°C führte zur Ausbildung von Mikrokristallen. Mittels Umkristallisation konnten diese in für die Röntgenstrukturanalyse geeignete Kristalle umgewandelt werden. Die Auswertung der aufgenommenen Diffraktionsbilder ergab eine nahezu perfekte, pseudomeroedrische Verzwilligung dieser Kristalle. Bei der Datenaufnahme weiterer Kristalle der gleichen Kristallisationsbedingung konnte jedoch ein Datensatz eines nicht-verzwillingten Kristalls bis zu einer Auflösung von 2,6 Å gemessen werden. Initiale Phasen wurden mittels der Methode des Molekularen Ersatzes, unter Verwendung der Koordinaten der kurz zuvor veröffentlichten IgA-Fc/FcαRI Komplexstruktur erhalten. Das extrazelluläre Fragment des FcαRI besteht aus zwei Immunglobulindomänen EC1 und EC2. Trotz der funktionellen Ähnlichkeit zu Fc-Rezeptoren, entspricht die Faltungstopologie der Domänen sowie die Orientierung der Domänen zueinander im Wesentlichen dem der Killer cell inhibitory (KIR) und Leukocyte Immunoglobulin-like (LIR) Rezeptoren. Der Vergleich der vier voneinander unabhängigen Moleküle innerhalb der kristallographischen, asymmetrischen Einheit zeigt eine erhebliche konformationelle Variabilität der Rezeptorstruktur, vor allem in dem Fc-IgA bindenden Bereich der EC1 Domäne. Die Überlagerung der bisher bekannten Strukturen des freien FcαRI und des mit Fc-IgA komplexierten FcαRI erlaubte eine ausführliche Analyse der Rezeptorstruktur in unterschiedlichen chemischen Umgebungen. Dabei ließ sich zeigen, dass der IgA bindende Bereich des freien Rezeptors die Konformation des Rezeptors in IgA gebundener Form annehmen kann, was die Theorie eines induced-fit Mechanismus dieser Interaktion nicht unterstützen kann. Diese Studien konnten weiterhin belegen, dass der Winkel zwischen den beiden Immunglobulindomänen sehr flexibel ist. Das humane Pathogen Streptococcus pyogenes hat verschiedene und komplexe Virulenzmechanismen entwickelt, um das Immunsystem des Menschen zu umgehen. Das erst kürzlich entdeckte Protein IdeS (Immunoglobulin G degrading enzyme of S. pyogenes) ist eine extrazelluläre Cysteinendoprotease dieses Pathogens, welche in der Lage ist, sehr spezifisch, Immunglobulin G zwischen dem Fab2 und Fc-Fragment proteolytisch zu spalten. Dies führt zur Inhibierung der Opsonophagozytose und verhindert die Zerstörung des Bakteriums durch humane polymorphkernige Neutrophile (PMN). Der Nachweis von Antikörpern gegen dieses Protein im Serum von Patienten mit Streptokokken-Infektionen sowie die ständige Expression der Protease während der Infektionen zeigt, dass IdeS ein wichtiger Virulenzfaktor ist. Da Streptococcus pyogenes eine Reihe von Krankheiten wie zum Beispiel Scharlach, Sepsis, Pharyngotonsillitis, Toxisches-Schock-Syndrom und das flesh-eating Syndrom verursacht, ist IdeS ein vielversprechendes Angriffsziel für die Entwicklung neuer und spezifischer Medikamente. Die Expression und Reinigung des IdeS Proteins und der katalytisch inaktiven C94S Mutante dieser Cysteinprotease wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert. Trotz der Mutation des für die Katalyse essentiellen Cysteinrestes C94 zu Serin behielt die Protease die Fähigkeit humanes Immunglobulin G zu binden, was mittels NMR Bindungsstudien bewiesen werden konnte. Das aktive Protein wurde noch während der Expression proteolytisch degradiert und war demzufolge nicht zur Kristallisation geeignet. Hingegen konnte die inaktive Mutante in der orthorhombischen Raumgruppe P21212 kristallisiert werden. Unter Verwendung von Synchrotron-Röntgenstrahlung konnten an diesen Kristallen native Daten bis zu einer Auflösung von 1,9 Å aufgenommen werden. Das Phasenproblem konnte mit Hilfe eines Multiwavelength Anomalous Dispersion (MAD) Experiments an Kristallen des mit Selenomethionin markierten Proteins gelöst werden. In der Elektronendichte der Kristallstruktur sind die Reste 49 – 339 des IdeS Proteins gut definiert. Obwohl die IdeS Protease keine Aminosäuresequenzhomologie zu anderen Proteasen aufweist, zeigt die Kristallstruktur die typische Faltungstopologie des Klans Papain-ähnlicher Cysteinproteasen. Die Polypeptidkette faltet sich in zwei getrennte Domänen L und R auf, die über eine ausgedehnte polare Interaktionsfläche miteinander verbunden sind. Neben dem für Cysteinproteasen dieser Familie konservierten Bereich aus vier -Helixes und sieben β-Strängen, besitzt IdeS einige umfangreiche Insertionen vor allem im Bereich der L-Domäne. Die Überlagerung der strukturell ähnlichen Proteine Cathepsin B und Papain mit der IdeS Struktur zeigt, dass auch der Bereich des aktiven Zentrums große Unterschiede aufweist. Die Kristallstruktur der IdeS C94S Mutante konnte belegen, dass IdeS zu einer neuen Familie des CA Klans der Cysteinproteasen gehört und außerdem eine Grundlage für die Entwicklung antibakterieller Medikamente darstellt.     «

Immunglobulin A ist die häufigste Antikörperklasse in den Schleimhäuten sowie den Schleimhautsekreten des Menschen und wirkt dort als eine erste immunologische Verteidigungslinie gegen angreifende Mikroorganismen. Im humanen Serum ist IgA die zweithäufigste Antikörperklasse und bildet eine zweite Verteidigungsbarriere gegen Pathogene, die bereits die mukösen Oberflächen durchdrungen haben. Die IgA spezifische Immunantwort wie Phagozytose, ADCC (antibody dependent cellular cytotoxicity), Präsenta...     »

In human immunglobulin A is the most abundant antibody class in mucosal secretions and is also found in high concentrations in serum. In fact, more IgA is produced per day than all other immunglobulin isotypes combined. FcαRI is the predominant receptor for IgA in the serum and mediates the IgA specific immune response such as phagocytosis, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, respiratory burst and cytokine release. The scientific interest in IgA and its receptor has increased recently owing to the fact that human cancers can be very effectively treated with therapeutic IgA antibodies, which trigger the lysis of tumour cells by binding to FcαRI present on polymorphonuclear neutrophils. To investigate the structural requirements for IgA-binding the extracellular region of FcαRI was cloned and overexpressed in Escherichia coli. The resulting inclusion body protein was refolded and purified. Despite its deglycosylated state this recombinant FcαRI retained its ability to bind human IgA. The recombinant receptor crystallised in space group P21 and the crystals diffracted to a limiting resolution of 2.6 Å using synchrotron radiation. The extracellular fragment of the FcαRI consists of two immunglobulin-like domains EC1 and EC2. The interdomain angle is stabilized by hydrophobic residues in the interface between these domains. Both domains have a KIR-like folding topology and the overall domain orientation resembles that seen in the leukocyte receptor family. In contrast to other immunglobulin Fc receptors the IgA binding site is located in the membrane-distal domain EC1 of the Fcα receptor I. Interestingly, different conformations of the D strand in the EC1 domain were observed for the four molecules in the asymmetric unit. In molecules A, B and D the D strand and the DE loop are part of the front β sheet (strands ABED) while in molecule C this strand shifts to the back βsheet (A’GFCC’), forming a C’ strand. Therefore, the energy barrier between these two conformations seems to be very low. Recently it was shown that a similar shift occurs during binding of the Fcfragment of IgA to the receptor. This finding provides a starting point for the rational design of mutants with this region fixed in the bound conformation. Such a stabilisation is important for the development of recombinant FcαRI based therapeutics required e.g. for the treatment of IgA nephropathy. The human pathogen group A Streptococcus (GAS) has developed complex and diverse virulence mechanisms to resist the host immune defense system. The recently identified protein IdeS (Immunoglobulin G-degrading enzyme of S. pyogenes) is an extracellular cysteine endopeptidase of Streptococcus pyogenes with an extraordinarily high degree of substrate specificity, catalyzing a single proteolytic cleavage at the lower hinge of human Immunoglobulin G. This proteolytic degradation promotes inhibition of opsonophagocytosis and interferes with the killing of group A Streptococcus. The presence of specific antibodies against IdeS in sera of patients with pharyngitis, acute rheumatic fever and severe invasive disease episodes and the continuous production of this protease during infection indicates that IdeS is a significant virulence determinant. Due to the fact that Streptococcus pyogenes is an important human bacterial pathogen and the causative agent for a variety of diseases, including pharyngotonsillitis, scarlet fever, septicemia and streptococcal toxic-shock syndrome IdeS represents a potential drug target. The crystal structure of the catalytically inactive mutant IdeS-C94S was solved by the MAD phasing method at a limiting resolution of 1.9 Å. Multiwavelength anomalous diffraction data were collected on a single crystal of the SeMet-incorporated IdeS-C94S at three wavelengths. Despite negligible sequence homology to known proteinases, the core of the structure resembles the canonical papain fold though with major insertions and a distinct substrate-binding site. The structural comparison of IdeS and papain indicates also differences concerning the type of residues involved in the catalytic mechanism. Based on analogy with inhibitor complexes of papain-like proteinases, a model for substrate binding by IdeS is proposed. The molecular structure of the substrate-binding groove explains the unusual inhibition profile of the enzyme, and the data support the view that additional exosite binding is likely to contribute to the high specificity of IdeS towards IgG. Summarized the analysis of the crystal structure, supports the biochemical evidence that IdeS is the first member of a novel family of cysteine proteinases and provides the experimental basis for the rational design of specific anti-bacterial drugs.     «

In human immunglobulin A is the most abundant antibody class in mucosal secretions and is also found in high concentrations in serum. In fact, more IgA is produced per day than all other immunglobulin isotypes combined. FcαRI is the predominant receptor for IgA in the serum and mediates the IgA specific immune response such as phagocytosis, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, respiratory burst and cytokine release. The scientific interest in IgA and its receptor has increased recently...     »