ATP-Sulfurylase (ATPS) ist das erste in einer Kaskade von Enzymen, die im Stoffwechselweg der Sulfataktivierung die intrazelluläre Aktivierung und den Einbau von Sulfat in organische Komponenten katalysieren. Nach der Aufnahme von Sulfat in die Zelle wird dieses durch die ATPS mit ATP zu Adenosin-5‘-phosphosulfat (APS) und Pyrophosphat umgesetzt. Dieses „aktivierte Sulfat“ wird dann nach enzymatischer 3‘-Phosphorylierung durch die APS-Kinase zu PAPS stufenweise zu Sulfid reduziert und in organische Moleküle eingebaut oder zur enzymatischen Sulfatisierung einer Vielzahl von Biomolekülen verwendet. In vielen chemotropen und prototrophen Mikroorganismen dient die ATPS zur Herstellung des lebensnotwendigen ATP. Damit spielt die ATPS in vielen Organismen vom anaeroben Bakterium bis zum Mensch nicht nur in der Biosynthese von schwefelhaltigen Molekülen wie z.B. Aminosäuren, Kohlehydraten oder Hormonen, sondern auch im gesamten Schwefelstoffwechsel eine wichtige Rolle. Die in dieser Arbeit ermittelte dreidimensionale, atomare Struktur der ATPS aus Saccharomyces cerevisiae ist die erste Kristallstruktur eines Vertreters der Familie der ATP-Sulfurylasen überhaupt. Das Enzym wurde nativ aus Bäckerhefe isoliert, charakterisiert und mit den erhaltenen trigonalen Kristallen die Struktur des Apoenzyms bei einer Auflösung von 1,95 Å unter Verwendung der Methode des Multiplen Isomorphen Ersatzes (MIR) gelöst. ATPS ist ein scheibenförmiger Enzymkomplex aus sechs identischen Untereinheiten, die in zwei Trimerenringen gegeneinander angeordnet und durch die D3-Symmetrie der Raumgruppe R32 miteinander verwandt sind. Das Protomer zeigt eine U-förmige Silhouette und läßt sich in vier Domänen einteilen, von denen drei charakteristische Faltungstypen aufweisen. Neben der ein beta-barrel beinhaltenden Domäne I und der Kinase-ähnlichen Faltung der C-terminalen Domäne IV zeigt die Domäne II den typischen Dinukleotid-Faltungstyp der Superfamilie der Nukleotidylyltransferasen. Bei einer starken strukturellen Übereinstimmung mit diesen verwandten alpha/beta-Phosphodiesterasen beherbergt Domäne II auch das aktive Zentrum des Enzyms, das trotz der analogen Architektur der Domäne einen vollkommen neuen und einzigartigen Nukleotidbindungsmodus mit eigenständigen und hoch konservierten Bin-dungsmotiven aufweist. Die Aufklärung des binären und des ternären Enzym-Produktkomplexes E•APS und E•APS•PPi erbrachte Hinweise auf einen mit den Nukleotidylyltransferasen vergleichbaren Reaktionsmechanismus, der nukleophilen Substitution mit stereochemischer Inversion am alpha-Phosphor des ATP. Die Bindungsart von ATP wurde durch Vergleich mit strukturell eng verwandten Nukleotidylyltransferasen durch Modellierungsexperimente abgeleitet. Mit Hilfe von Enzym-Inhibitorkomplexen, z.B. mit ADP oder Chlorat, konnte dabei das schon bei den Produktkomplexen beobachtete Auftreten eines mit einem induced fit kombinierten displacement-Mechanismus bestätigt werden, der bei Nukleotidbindung drastische Konformationsänderungen von einigen wenigen Aminosäuren im aktiven Zentrum auslöst und zu strukturellen Verschiebungen ganzer Domänen innerhalb des Protomers führt. Dieser Substraterkennungs- und aktivierungsmechanismus scheint ein essentielles Element für den Katalysezyklus der ATPS zu sein und ist in homologen Enzymen z.B. aus P. chrysogenum erhalten. Untersuchungen an diesen verwandten Enzymen zeigen, daß er möglicherweise im Zusammenhang mit weitreichenderen, allosterischen Effekten zur Regulation der Enzymaktivität steht.     «

ATP-Sulfurylase (ATPS) ist das erste in einer Kaskade von Enzymen, die im Stoffwechselweg der Sulfataktivierung die intrazelluläre Aktivierung und den Einbau von Sulfat in organische Komponenten katalysieren. Nach der Aufnahme von Sulfat in die Zelle wird dieses durch die ATPS mit ATP zu Adenosin-5‘-phosphosulfat (APS) und Pyrophosphat umgesetzt. Dieses „aktivierte Sulfat“ wird dann nach enzymatischer 3‘-Phosphorylierung durch die APS-Kinase zu PAPS stufenweise zu Sulfid reduziert und in organis...     »

ATP sulfurylases (ATPS) are ubiquitous enzymes which catalyze the primary step of intracellular sulfate activation: the reaction of inorganic sulfate with ATP to form adenosine-5’-phosphosulfate (APS) and pyrophosphate. With the crystal structure of ATPS from the yeast Saccharomyces cerevisiae we have solved the first structure of a member of the ATP sulfurylase family. We have analyzed the crystal structure of the native enzyme at 1.95 Å resolution using multiple isomorphous replacement (MIR) and subsequently the ternary enzyme product complex with APS and PPi bound to the active site. The enzyme consists of six identical subunits arranged in two stacked rings in a D3 symmetric assembly. Nucleotide binding causes significant conformational changes which lead to a rigid body structural displacement of domains III and IV of the ATPS monomer. Despite having similar folds and active site design, the examination of the active site of ATPS and the comparison with known structures of related nucleotidylyl transferases reveal a novel ATP binding mode, which is peculiar to ATP sulfurylases. It has been shown previously that the enzyme catalyzes the generation of APS from ATP and inorganic sulfate in vitro and in vivo and that this reaction can be inhibited by a number of simple molecules. We have also solved the crystal structures of ATPS complexed with compounds, which have inhibitory effects on the catalytic reaction of ATPS: Thiosulfate and ADP mimic the substrates sulfate and ATP in the active site, but are non-reactive and thus competitive inhibitors of the sulfurylase reaction. Chlorate is bound in a crevice between the active site and the intermediate domain III of the complex structure. It forms hydrogen bonds to residues of both domains and stabilizes a “closed” conformation inhibiting the release of the reaction products APS and PPi. These new observations are evidence for the crucial role of the displacement mechanism for the catalysis by ATP sulfurylase. Investigations with the related homologue of P. chrysogenum confirm a connection of this mechanism with further allosteric regulation mechanisms of this enzyme class.     «

ATP sulfurylases (ATPS) are ubiquitous enzymes which catalyze the primary step of intracellular sulfate activation: the reaction of inorganic sulfate with ATP to form adenosine-5’-phosphosulfate (APS) and pyrophosphate. With the crystal structure of ATPS from the yeast Saccharomyces cerevisiae we have solved the first structure of a member of the ATP sulfurylase family. We have analyzed the crystal structure of the native enzyme at 1.95 Å resolution using multiple isomorphous replacement (MIR) a...     »