4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF, Furaneol®) ist der wichtigste, qualitätsbestimmende Aromastoff der Erdbeerfrucht. Vorangegangene Untersuchungen zeigten, dass die Biosynthese dieses Geruchsstoffes auf der Stufe des D-Fructose-1,6-diphosphats vom Primärstoffwechsel abzweigt. Teilsequenzen eines aus Erdbeerfrüchten isolierten Proteins, welches in der Lage ist HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat und NAD(P)H zu bilden, waren vollständig identisch mit der Proteinsequenz einer mutmaßlichen NAD(P)H-abhängigen Chinonoxidoreduktasen-cDNA aus Erdbeeren. Des Weiteren gab es Übereinstimmungen im Expressionsmuster, dem Methioningehalt und der Proteingröße. Die Oxidoreduktase (FaEO), sowie ein ähnliches Enzym der Tomatenfrucht, wurden im Rahmen dieser Arbeit in Escherichia coli heterolog exprimiert, aufgereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Der Nachweis der HDMF-Bildung durch FaEO ist durch die Analyse von Reaktionsansätzen aus D Fructose-1,6-diphosphat, NADH und FaEO erbracht worden. Hierbei wurden das pH-Optimum, die Kosubstratabhängigkeit, die Hitzeinhibierung und die Enantioselektivität bestimmt. Allerdings zeigte sich insbesondere wegen der langen Umsetzungszeiten, dass D Fructose 1,6-diphosphat nicht das eigentliche Substrat von FaEO sein konnte. Aus diesem Grund wurden weiterführende Untersuchungen zur Identifizierung des Vorläufers von HDMF durchgeführt. 1-Desoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat, welches bei der Biosynthese von HDMF in Hefen als Zwischenverbindung beschrieben wurde, konnte in Erdbeeren als Vorläufer ausgeschlossen werden. Die Synthese des α, β-ungesättigten 4 Hydroxy-5-methyl-2-methylen-3(2H)-furanon (HMMF) führte schließlich zum Erfolg. FaEO war in der Lage im Reaktionsansatz unter Verbrauch von NADH die Doppelbindung von HMMF selektiv zu reduzieren und so HDMF darzustellen. Die NMR-Analytik zur Strukturabsicherung der neuen und reaktiven, aus 4 Hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (HMF) und Formaldehyd, synthetisierten Verbindung HMMF gelang erst nach Herabsetzung der Reaktivität durch eine Derivatisierung als Thioether. Der Nachweis des postulierten Prekursors HMMF in vivo erfolgte gleichfalls über die Derivatisierung als Thioether. Die Applikation von 3-Mercaptobenzoesäure (MBS) an Erdbeeren in verschiedenen Reifestadien unterbrach die Biosynthese von HDMF auf der Stufe von HMMF, da dieses mit dem Thiol zum Thioether reagierte. Der Thioether konnte in den anschließenden Messungen mittels HPLC-MS/MS-Untersuchungen nachgewiesen werden. In grünen Früchten wurden keine, in Erdbeeren des pinkfarbenen Stadiums größere und in roten Früchten die größten Mengen an Thioether detektiert. Diese Ergebnisse gehen konform mit der reifekorrelierten Expression von FaEO und der reifekorrelierten Bildung von HDMF in Erdbeeren. Auch in anderen HDMF-enthaltenden Früchten, in Ananas und Tomate, gelang es auf diesem Weg HMMF nachzuweisen. Durch Applikation an Erdbeerfrüchte wurde stabil markierte Glucose in den Biosyntheseweg von HDMF eingeschleust. Dieser wurde wieder durch ebenso applizierte MBS auf der Stufe von HMMF unterbrochen. Die stabile Markierung konnte durch HPLC-MS/MS-Experimente im Furanon-Teil des Thioethers wieder gefunden werden. Das Gen von FaEO, FaQR (Fragaria ananassa Quinone Oxidoreductase), wurde, basierend auf dem Vergleich der cDNA-Sequenz mit Datenbankeinträgen, zunächst der Klasse der NAD(P)H abhängigen Chinonoxidoreduktasen zugeordnet. Ein Substratscreening von FaEO mit Chinonen ergab, dass ausschließlich 9,10 Phenanthrenchinon (PQ), eine synthetische Verbindung, unter Verbrauch von NADH umgesetzt wurde. P-Chinone wurden, wie auch weitere Vertreter aus den Klassen der o Chinone und o Diketoverbindungen, nicht als Substrate akzeptiert. Auch bekannte α, β-ungesättigte Aldehyde, Ketone, Carbonsäuren und Amide stellten, ebenso wie Flavone, keine Substrate für FaEO dar. Aus diesem Grund wurden weitere α, β-ungesättigte HMMF-strukturanaloge 4 Hydroxy 3(2H)-furanone mit unterschiedlichen Substituenten an der Doppelbindung [u. a. 2-Ethyliden-4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (EDHMF); 4-Hydroxy-5-methyl-2-propyliden-3(2H)-furanon (HMPDF); 2 Butyliden-4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (BDHMF)] synthetisiert. Die Charakterisierung der teilweise bislang unbekannten, synthetisierten Verbindungen sowie der zum Teil neu beschriebenen enzymatischen Produkten erfolgte durch HPLC-MS/MS-, GC-MS-, GC-O- und HPLC-DAD-Messungen. HDMF, das enzymatisches Produkt aus HMMF, und EHMF [2 (oder 5)-Ethyl-4-hydroxy-5 (oder 2)-methyl-3(2H)-furanon], das Produkt aus EDHMF, sind als wichtige Aromakomponenten in verschiedenen Lebensmitteln beschrieben. Die längerkettigen Substrate und Produkte BDHMF, HMPDF, BHMF und HMPF zeigten in GC-Olfaktometrie-Analysen ebenfalls ausgeprägte Geruchsaktivitäten. Es gelang kinetische Daten zu FaEO mit den umgesetzten längerkettigen, synthetisierten Verbindungen und PQ zu gewinnen. Für HMMF hingegen konnten aufgrund der hohen Reaktivität keine reproduzierbaren kinetischen Daten erhalten werden. Die Substratstudien zeigten, dass FaEO eine Substratspezifität besitzt, die sich auf α, β-ungesättigte Doppelbindung, die mindestens ein Wasserstoffatom am β-C-Atom besitzen und gleichzeitig nicht mit einer weiteren Doppelbindung in trans-Stellung konjugiert sind beschränkt. Weiter entfernte Doppelbindungen, ob C=O oder C=C, oder ein weiterer Sauerstoff in der Nähe der Ketogruppe schienen die Reaktivität auch zu beeinflussen. Des Weiteren wiesen die Ergebnisse mit Benzil, welches nicht als Substrat akzeptiert wurde, darauf hin, dass das aktive Zentrum von FaEO nur planare Moleküle umsetzen kann. Überraschenderweise ließ sich FaEO anhand der biochemischen Ergebnisse nicht klar in eines der in der Literatur beschriebenen Schemata von NAD(P)H-abhängigen Chinonoxidoreduktasen einordnen. Des Weiteren stellt das Chinon PQ nicht das in der Erdbeere vorkommende Substrat der mutmaßlichen NAD(P)H-abhängigen Chinonoxidoreduktase dar. Da das Enzym in vivo die Doppelbindung des Enons HMMF reduziert, wurde der Name FaEO (Fragaria ananassa Enon Oxidoreduktase) dem der Chinonoxidoreduktase vorgezogen. Die Charakteristika der Umsetzungen von PQ und der ungesättigten Hydroxyfuranone unterschieden sich nicht nur in den katalytischen Effizienzen, sondern auch im pH-Optimum und vor allem im Reaktionsmechanismus. Durch die Aufklärung der Stöchiometrie der Reaktionen, die Identifizierung eventuell entstandener Produkte und die Probe auf Radikale stellte sich heraus, dass FaEO abhängig vom zur Verfügung stehenden Substrat (Chinon oder ungesättigtes Hydroxyfuranon) unterschiedliche Reaktionsmechanismen katalysieren kann. So wird PQ über eine Ein-Elektronen-Übertragung zum instabilen Semichinonradikal umgesetzt, während aus den ungesättigten 4-Hydroxy-3(2H)-furanonen die gesättigten Analoga über eine Zwei-Elektronen-Übertragung gebildet werden. Da auch in der Tomate HMMF, das Substrat der Enonoxidoreduktase, nachgewiesen werden konnte, wurde in dieser Frucht nach einem ähnlichen Enzym wie FaEO gesucht. Schließlich konnte dieses mit Hilfe einer Tomatenexpressionsdatenbank identifiziert werden (71 % Übereinstimmung auf Proteinebene). Die Klonierung, heterologe Expression und biochemische Charakterisierung der LeEO (Lycopersicum esculentum Enonoxidoreduktase) erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie bei FaEO und ergab, dass die Eigenschaften von LeEO nur geringfügig von denen von FaEO abwichen, z. B. durch ein etwas höheres pH Optimum, eine höhere katalytische Effizienz gegenüber PQ und dem Chloroplastentransitpeptid am N terminalen Ende der Sequenz. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in der vorliegenden Studie mit der Entdeckung von HMMF als Intermediat und FaEO als umsetzendes Enzym ein weiterer wichtiger Schritt in der Aufklärung der Biosynthese von HDMF gelungen ist. Lediglich die Transformation von D-Fructose-1,6-diphosphat zu HMMF, welche eine Dephosphorylierung und Dehydratisierung beinhaltet, ist noch ungeklärt. Gleichzeitig gelang mit der Charakterisierung einer vermeintlichen NAD(P)H-abhängigen Chinonoxidoreduktase als Enon Oxidoreduktase, die Beschreibung eines Enzyms, das in der Lage ist, substratabhängig zwei verschiedene Reaktionsmechanismen zu katalysieren. Ein homologes Enzym LeEO konnte auch in Tomaten nachgewiesen und charakterisiert werden.      «

4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF, Furaneol®) ist der wichtigste, qualitätsbestimmende Aromastoff der Erdbeerfrucht. Vorangegangene Untersuchungen zeigten, dass die Biosynthese dieses Geruchsstoffes auf der Stufe des D-Fructose-1,6-diphosphats vom Primärstoffwechsel abzweigt. Teilsequenzen eines aus Erdbeerfrüchten isolierten Proteins, welches in der Lage ist HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat und NAD(P)H zu bilden, waren vollständig identisch mit der Proteinsequenz einer mutmaßlichen N...     »

Previous studies have revealed that D-fructose-1,6-biphosphate plays a central role in the biosynthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (HDMF), one of the most important flavor compounds in the strawberry. Furthermore, partially purified protein extracts from the strawberry have been shown to build HDMF from D-fructose-1,6-biphosphate in the presence of NADH. The enzymatic activity could be correlated with the presence of a single polypeptide, which contained two peptide fragments that showed total identity with the protein sequence of a putative quinone oxidoreductase (Fragaria ananassa quinone oxidoreductase) that is ripening induced. Additionally, there were similarities in the expression pattern, the amount of methionine, and the size. In this study, the enzyme from strawberry and a similar enzyme from tomato were heterologously expressed in E. coli, purified and biochemically characterized. We confirmed, in vitro, that the heterologously expressed enzyme catalyzes the formation of HDMF from D fructose-1,6-biphosphate and NADH. In addition we determined the pH-optimum, co substrate dependencies, inactivation by heat, and the enantiomer selectivity of this enzyme. During the characterization process, it became clear from the results of longer reactions, that D-fructose-1,6-biphosphate was probably not the native substrate. Thus, additional studies on the identification of the precursor of HDMF were initiated. One option for this precursor was the compound 1-desoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat, which is known to be the precursor of HDMF in yeasts. In this study, we were able to show that it is not the precursor of HDMF in strawberries. To identify the true substrate of the enzyme we synthesized the α, β unsaturated 4-hydroxy-5-methyl-2-methylene-3(2H)-furanone (HMMF). In the presence of NADH, the enzyme reduced the double bond of this compound to form HDMF. The previously unknown compound, HMMF, was synthesized by adding formaldehyde to 4 hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone (HMF). To proof the structure of HMMF by NMR, its reactivity required its derivatisation as a thioether. This derivatisation was also necessary to show that HMMF was indeed the precursor in vivo. The application of 3 mercapto-benzoic-acid (MBA) to strawberries at different ripening stages interrupted the biosynthesis of HDMF because the precursor, HMMF, reacted with the thiol to form a thioether. This thioether was detected in subsequent HPLC-MS-measurements. Additionally the formation of thioether correlated with the ripening stage of the fruit, as do the formation of HDMF, and the expression of the enzyme. The proof of HMMF by this method was also successful in several other HDMF containing fruits, like the pineapple and tomato. Additionally, we were able to show that, as expected, D-glucose is transformed into HMMF during the biosynthesis of HDMF. The application of 6 13C-D-glucose to strawberries that were later treated with MBA enabled us to confirm the incorporation of the labelled sugar into the furanone part of the thioether. At first the gene FaQR (Fragaria ananassa quinone oxidoreductase) was classified as a NAD(P)H-quinone oxidoreductase based on sequence-similarities with known QRs. However, a substrate screening with several quinones revealed that the enzyme accepted only 9,10 phenanthrenequinone (PQ), an artificial quinone, as a substrate. Other o quinones, p-quinones, α, β-unsaturated aldehydes, ketones, acids, amides, and flavones were not accepted. Thus it was necessary to synthesize more substrates [such as 2 ethylidene-4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone (EDHMF), 4-hydroxy-5-methyl-2-propylidene-3(2H)-furanone (HMPDF); 2 butylidene-4-hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanone (BDHMF)] with the same unsaturated double bond as HMMF, but with different substitutions. These compounds were synthesized and characterized by HPLC-MS/MS-, GC-MS-, GC-O- and HPLC-DAD-data for the first time in this study. Additionally, the enzymatically formed products were only partially known, e.g. HDMF formed from HMMF and EHMF (2 (or 5)-Ethyl-4-hydroxy-5 (or 2)-methyl-3(2H)-furanone) formed from EDHMF. These two compounds are important flavor compounds in several foods. Consistent with this, the related structures BDHMF, BHMF, HMPDF, and HMPF revealed similar odor activities. Kinetic data was obtained for EDHMF, HMPDF, BDHMF, and PQ. Due to its high reactivity we were not able to gain kinetic data for HMMF. This study shows that the enzyme reduces the α, β-unsaturated double bond in those compounds that also have at least one hydrogen atom in the β-position and no second double bond in the trans position. Other double bonds or oxygen nearby doesn’t interfere with the activity. The lack of enzymatic activity with benzil as the substrate shows that FaEO accepts only planar molecules. Surprisingly, it was not possible to clearly classify the enzyme based solely on biochemical studies. Since we have shown in vivo that HMMF and not PQ is the substrate, we prefer the name FaEO (Fragaria ananassa enone oxidoreductase) to quinone oxidoreductase. This we appropriate, because the two reactions differ not only in their catalytic efficiencies, but also in their optimal pH and reaction mechanism. Using measurements of the stochiometry of radicals and products, we were able to confirm that the reaction mechanism of FaEO depends on whether the available substrate is an unsaturated hydroxyfuranone or a quinone. PQ is transformed into its unstable semiquinone-radical by a one-electron-reduction, whereas, when the unsaturated hydroxyfuranones are available, FaEO catalyzes a two-electron-reduction and forms the saturated compounds. Since we could detect HMMF in tomato fruit, it wasn’t surprising that we also found a sequence similar to FaEO in a tomato expression database. The protein was heterologously expressed and the enzyme, LeEO (Lycopersicum exculentum enone oxidoreductase), showed similar characteristics as FaEO. The optimal pH and the catalytic performance were slightly higher, and there was a transit peptide at the N-terminus of the sequence. In this study, by discovering HMMF, the precursor, and FaEO, the responsible enzyme we have uncovered another important step in the biosynthesis of HDMF. Now only the transformation of D-Fructose-1,6-biphosphate to HMMF, which includes a dephosphorylation and a dehydration, remains unknown. Finally, we were able to characterize FaEO as an enzyme able to carry out two different reaction mechanisms depending on the available substrate. The characterization of LeEO, a homologous enzyme from the tomato, confirms these results.      «

Previous studies have revealed that D-fructose-1,6-biphosphate plays a central role in the biosynthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (HDMF), one of the most important flavor compounds in the strawberry. Furthermore, partially purified protein extracts from the strawberry have been shown to build HDMF from D-fructose-1,6-biphosphate in the presence of NADH. The enzymatic activity could be correlated with the presence of a single polypeptide, which contained two peptide fragments that...     »