The formation of thick viscous scum layers is a persistent problem in wastewater treatment plants (WWTPs) observed all over the world. Three factors are necessary for scum formation: (i) dispersed gas bubbles, (ii) surface-active material and (iii) hydrophobic compounds. For instance, air bubbles in the aeration tank initialize scum development. The gas-water interface is stabilized by the adsorption of surface-active molecules. The presence of hydrophobic material provides stable adhesion to solid particles promoting persistent scum layers. Surface-active substances may enter the WWTP via primary effluent or be produced by various bacteria in the presence of hydrophobic carbon sources and under nutrient deficiency. Hydrophobic material might originate from the primary effluent or be available by an abundant growth of organisms with hydrophobic cell surfaces. One objective of this study was to characterize the relevant bacteria that are involved in scum formation. The identification of these bacteria was performed by classical microscopic sludge analysis and molecular biological methods to obtain information about their taxonomic affiliation. The knowledge about the phylogeny of scum bacteria might reveal physiological properties of these bacteria, which is helpful for the understanding of the scum formation process and the application of specific control measures. A further topic of this study was to investigate whether scum formation is a passive floating mechanism of activated sludge to the water surface or an active growth process of a specific scum biocenosis close to the water surface. The elucidation of the role of these scum bacteria and extracellular polymeric substances (EPS) in the formation of stable scum layers was the third objective of this work. EPS might perform two different functions in the scum process: (i) they serve as nutrient source and promote the growth of a specific bacterial biocenosis and (ii) they directly stabilize scum layers due to their hydrophobic sites. For this purpose, scum bacteria numbers quantified by fluorescence in situ hybridization (FISH) were correlated to sludge hydrophobicity and specific EPS components extracted from activated sludge and scum. A screening of various WWTPs with scum formation revealed that in most plants examined Microthrix parvicella dominated the activated sludge and scum biocenoses. Furthermore nocardioform actinomycetes could be characterized as important scum bacteria. These microorganisms were found at very low numbers in activated sludge whereas they were clearly enriched in scum layers. The filamentous type 1863 found in several WWTPs was clearly enriched in the scum fraction but never detected as the dominant microorganism within the biocenosis. The filamentous bacterial morphotypes 1851, 0041/0675, 0092, and Nostocoida limicola were identified only in some WWTPs as the dominant organisms. However, they were often found concomitantly in M. parvicella- and nocardioform actinomycetes-dominated biocenoses. The identification of filamentous bacterial morphotypes by classical microscopy often failed because of morphological and taxonomic variations. Therefore the FISH technique using specific rRNA-targeted oligonucleotide probes was applied to reveal reliable phylogenetic information on these described morphotypes. The effectiveness of the two methods, classical sludge analysis and FISH, for detection, identification, and quantification of filamentous organisms in activated sludge and scum was compared. Classical sludge analysis and FISH corresponded well in the case of filamentous M. parvicella, which was identified as “Candidatus Microthrix parvicella”, an unclassified member of the Actinobacteria. Type 1863 was characterized as Acinetobacter spp. and type 1851 was identified as a member of the Chloroflexi subdivision 3, closely related to Roseiflexus castenholzii. Classical microscopy overlooked nocardioform actinomycetes and type 1863 single cells, which FISH detected only. Furthermore the non-branched filamentous nocardioform actinomycetes growing as short filaments or in cell clusters were clearly identified by FISH only. FISH underestimated branched filamentous nocardioform actinomycetes and morphotypes 0041/0675 or 0092 because of insufficient cell wall permeability for fluorescently labeled rRNA-targeted oligonucleotide probes, and also because of their taxonomic variability and consequently the availability of adequate probes. FISH results for N. limicola morphotypes I and III are still insufficient because of both their low in situ numbers and due to their high taxonomic variability. However, morphotype N. limicola II was frequently identified as “Candidatus Nostocoida limicola” belonging to the Actinobacteria phylum. The identification of the nocardioform actinomycetes at genus and species level was limited by classical microscopy because the different species exhibit mostly the same morphotype. The use of FISH for this purpose was restricted due to the deficit of available genera- and species-specific probes. The application of the full-cycle rRNA approach, combined with nucleic acid fingerprinting methods, restriction fragment length polymorphism (RFLP) and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), proved to be a successful approach to identify unknown nocardioform actinomycete species in different scum samples. A screening of the clone libraries with Actinobacteria-specific primers followed by RFLP profiling allowed to organize clone libraries into taxonomic groups and the identification of the dominant clones for each library. The analysis of environmental DNA by DGGE and the comparison with DGGE patterns of the dominant clones indicate that the dominant clone insert represented the dominant species within the Actinobacteria phylum of the microbial scum communities analyzed. However, only the sequence analysis of clone inserts followed by probe design and the application of FISH using specific probes for Dietzia spp. and various Rhodococcus spp. (R. erythropolis and probably two new species within the Rhodococcus radiation) verified and quantified the presence of these organisms. FISH quantification revealed that these different Rhodococcus species, characterized by a typical branched filamentous morphotype (GALO), were found in high numbers in the scum fraction originating from German WWTPs. They were often accompanied by Dietzia spp. growing as non-branched short filaments or in cell clusters generally found in lower numbers. In contrast, scum samples in Australian WWTPs were dominated by Gordonia spp. and Skermania piniformis. The occurrence of the described nocardioform actinomycete species could be correlated with different growth conditions in the WWTPs concerning temperature and the availability of specific carbon sources. Physicochemical analyses such as hydrophobicity measurements and EPS characterization combined with FISH quantification of the dominant scum bacteria were performed on sludge samples originating from M. parvicella- and nocardioform actinomycetes-dominated plants with scum events. In addition, respiratory activity was monitored in activated sludge and scum to define growth strategy and ecological niche of M. parvicella and nocardioform actinomycetes. Lipophilic substances originating from the primary effluent and being adsorbed to the activated sludge EPS promoted the growth rate of M. parvicella, which was shown to be more active in activated sludge as compared to scum. The long hydrophobic M. parvicella filaments enlarge and hydrophobize the surface structure of activated sludge flocs causing stable adhesion to gas bubbles. Thus these flocs are assumed to just passively float to the water surface producing persistent scum layers. In contrast, a higher respiratory activity in the scum biocenosis as compared to the activated sludge biocenosis was determined in nocardioform actinomycetes-dominated WWTPs. Therefore nocardioform actinomycetes as was shown for several Rhodococcus species and Dietzia spp. might enhance their population density by actively growing in the floated sludge fraction. This is supported by the low numbers of nocardioform actinomycetes detected in activated sludge and the clear enrichment of these organisms in the scum fraction. The active growth process in the scum layer is genera- and species-dependent, promoted by different scum EPS compounds such as lipophilic substances or other not yet characterized substances in addition to proteins and carbohydrates. Both high numbers of Rhodococcus spp. and lipophilic substances on the water surface caused hydrophobicity and thus scum formation. The described different scum formation strategies lead to various control measures with M. parvicella to be controlled in the activated sludge fraction and nocardioform actinomycetes to be fought in the scum fraction. This study revealed that different nocardioform actinomycete species found in the scum layer require specific growth conditions. Therefore the troubleshooting measures for nocardioform actinomycetes-dominated scum should be based upon a reliable taxonomic identification at genus and species level.      «

The formation of thick viscous scum layers is a persistent problem in wastewater treatment plants (WWTPs) observed all over the world. Three factors are necessary for scum formation: (i) dispersed gas bubbles, (ii) surface-active material and (iii) hydrophobic compounds. For instance, air bubbles in the aeration tank initialize scum development. The gas-water interface is stabilized by the adsorption of surface-active molecules. The presence of hydrophobic material provides stable adhesion to so...     »

Die Bildung von dickem viskosem Schaum stellt ein häufiges Problem in Abwasser-reinigungsanlagen (ARA) dar. Drei Faktoren spielen bei der Entwicklung von stabilen Schäumen eine wichtige Rolle: (i) fein verteilte Gasblasen, (ii) oberflächenaktive Substanzen und (iii) hydrophobe Stoffe. In der belüfteten Phase entstehen die Gasblasen z.B. durch Sauerstoffeintrag und initiieren die Schaumbildung. Die Grenzflächen zwischen der Gas- und Wasserphase werden durch Adsorption von oberflächenaktiven Substanzen stabilisiert. Das Vorkommen von hydrophoben Stoffen unterstützt die Adhäsion dieser Gasblasen an Feststoffpartikel, wodurch die Bildung von stabilen Schaumschichten gefördert wird. Oberflächenaktive Stoffe können über den Zulauf in die Anlage gelangen oder von verschiedenen Bakterien in der Anwesenheit von hydrophoben Kohlenstoffquellen bzw. unter Nährstoffmangel produziert werden. Hydrophobe Substanzen können aus dem Abwasser stammen oder werden durch das starke Wachstum von Organismen mit einer stark hydrophoben Zelloberfläche zur Verfügung gestellt. Eine Zielsetzung dieser Studie war es, die relevanten Schaum-Bakterien, welche an der Schaumbildung beteiligt sind, zu charakterisieren. Die Identifizierung dieser Bakterien wurde anhand der klassischen mikroskopischen Schlammanalyse und molekularbiologischen Methoden, welche Information über die taxonomische Zugehörigkeit liefern, durchgeführt. Das Wissen über die Phylogenie der Schaum-Bakterien gibt Hinweise zu den physiologischen Eigenschaften dieser Bakterien, welche hilfreich sind für das Verstehen des Schaumbildungsprozesses und die Anwendung spezifischer Kontrollmaßnahmen. Eine weitere Frage dieser Arbeit war es zu untersuchen, inwieweit die Schaumbildung einen passiven Flotationsprozess des Belebtschlammes an die Wasseroberfläche oder einen aktiven Wachstumsprozess von spezifischen Bakterien an der Wasseroberfläche darstellt. Die Aufklärung der Rolle dieser Schaum-Bakterien und der extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) bei der Bildung von stabilen Schäumen stellte den dritten Arbeitschwerpunkt dar. EPS erfüllen möglicherweise zwei verschiedene Funktionen im Schaumbildungsprozess: (i) sie dienen als Nährstoffquelle und fördern das Wachstum einer speziellen bakteriellen Biozönose und (ii) sie können aufgrund ihrer hydrophoben Oberflächen die Schaumschicht direkt stabilisieren. Zur Beantwortung dieser Fragen wurde die Anzahl der Schaum-Bakterien, die mit Hilfe der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) quantifiziert wurde, mit der Schlammhydrophobizität und spezifischen EPS-Komponenten des Belebtschlammes und der Schaummatrix korreliert. Die Screening-Untersuchungen an verschiedenen ARA mit Schaumereignissen zeigten, dass in den meisten untersuchten Anlagen Microthrix parvicella sowohl die Schlamm- als auch die Schaumbiozönosen dominierte. Weiter konnten nocardioforme Actinomyceten als wichtige Schaumbakterien charakterisiert werden. Diese Organismen wurden in geringer Anzahl im Belebtschlamm gefunden und waren in der Schaumschicht deutlich angereichert. Das fadenförmige Bakterium Typ 1863 wurde in mehreren ARA deutlich angereichert im Schaum gefunden, wurde aber niemals als dominanter Organismus innerhalb der Biozönose nachgewiesen. Die fadenförmigen Morphotypen 1851, 0041/0675, 0092 und Nostocoida limicola wurden nur in einigen ARA als die dominanten Organismen im Belebtschlamm identifiziert. Jedoch wurden sie häufig zusammen mit M. parvicella- und nocardioforme Actinomyceten-dominierten Biozönosen gefunden. Die Identifizierung von fadenförmigen Bakterienmorphotypen ist häufig aufgrund von morphologischen Abweichungen und unvollständigen taxonomischen Informationen fehlerhaft. Deshalb wurde die FISH-Technik unter Verwendung von spezifischen rRNA-gerichteten Oligonukleotidsonden eingesetzt, um verlässliche phylogenetische Informationen über die beschriebenen Morphotypen zu erhalten. Die beiden Methoden, die klassische mikroskopische Schlammanalyse und FISH, wurden in Bezug auf ihre Effektivität zum Nachweis, zur Identifizierung und zur Quantifizierung fadenförmiger Organismen im Belebtschlamm und Schaum verglichen. Für den Morphotyp M. parvicella, welcher als „Candidatus Microthrix parvicella“ (ein nicht-klassifiziertes Bakterium der Actinobacteria) identifiziert wurde, stimmten die Ergebnisse der klassischen Schlammanalyse und FISH gut überein. Typ 1863 wurde als Acinetobacter spp. charakterisiert und Typ 1851 wurde als Bakterium der Chloroflexi Gruppe 3, nah verwandt mit Roseiflexus castenholzii, identifiziert. Die klassische Mikroskopie übersieht Einzelzellen der nocardioformen Actinomyceten und des Typs 1863, welche nur mit FISH nachgewiesen werden konnten. Weiterhin wurden unverzweigte nocardioforme Actinomyceten, die als kurze Fäden oder in Zellcluster wuchsen, nur mit FISH eindeutig identifiziert. Die FISH-Methode unterschätzt die Anzahl der verzweigten fadenförmigen nocardioformen Actinomyceten und der Morphotypen 0041/0675 oder 0092. Die Ursachen hierfür sind erstens die limitierte Zellwandpermeabilität für fluoreszenzmarkierte rRNA-gerichtete Oligo-nukleotidsonden und zweitens die Verfügbarkeit von geeigneten Sonden. Die FISH-Ergebnisse für den Morphotyp N. limicola I und III sind sowohl wegen ihrer geringen Anzahl als auch wegen ihrer taxonomischen Vielfalt wenig aussagekräftig. Der Morphotyp N. limicola II wurde jedoch häufig als „Candidatus Nostocoida limicola“ aus der Gruppe der Actinobacteria identifiziert. Die Identifizierung der nocardioformen Actinomyceten auf Gattungs- und Artebene mit Hilfe der klassischen Mikroskopie war nicht möglich, da die verschiedenen Arten zumeist den gleichen Morphotyp aufweisen. Der Einsatz von FISH für diesen Zweck war aufgrund des Mangels an verfügbaren gattungs- und artspezifischen Sonden ebenso begrenzt. Die Anwendung des „full-cycle“ rRNA-Ansatzes in Kombination mit verschiedenen DNA-Fingerprint-Methoden, dem Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) und der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) erwies sich als eine erfolgreiche Methode zur Identifizierung der unbekannten nocardioformen Actinomyceten-Arten in den verschiedenen Schaumproben. Das Screening der Klonbibliotheken mit Actinobacteria-spezifischen Primern gefolgt von der Erstellung von RFLP-Profilen machte es möglich, die Klone in taxonomische Gruppen zu ordnen, und erlaubte die Identifizierung der dominanten Klone der einzelnen Klonbibliotheken. Die Analysen der Umwelt-DNA mit Hilfe der DGGE und der Vergleich zu den DGGE-Mustern der dominanten Klone wiesen darauf hin, dass die dominanten Klon-Inserte die dominanten Bakterien innerhalb der Actinobacteria der untersuchten mikrobiellen Schaumbiozönosen repräsentierten. Jedoch nur die Sequenzanalyse von Klon-Inserten gefolgt von Sondendesign und die Anwendung von FISH mit spezifischen Sonden für Dietzia spp. und verschiedenen Rhodococcus spp. (Rhodococcus erythropolis und wahrscheinlich zwei neue Arten der Gattung Rhodococcus) bestätigten und quantifizierten das Vorkommen dieser Organismen. Die FISH-Quantifizierung zeigte, dass die verschiedenen Rhodococcus-Arten, welche durch den typisch verzweigten fadenförmigen Morphotyp (GALO) charakterisiert waren, in hoher Anzahl in der Schaumfraktion der deutschen ARA vorkamen. Sie traten häufig zusammen mit Dietzia spp. auf, welche als kurze unverzweigte Fäden bzw. in Zellcluster wuchsen und im Allgemeinen in geringerer Anzahl gefunden wurden. Im Gegensatz dazu dominierten in den Schaumproben der australischen ARA Gordonia spp. und Skermania piniformis. Das Vorkommen der beschriebenen nocardioformen Actinomyceten-Arten konnte mit den verschiedenen Wachstumsbedingungen der ARA, welche Temperatur und die Verfügbarkeit von spezifischen Kohlenstoffquellen betreffen, korreliert werden. Die physikochemischen Analysen, welche die Messung der Hydrophobizität und die Charakterisierung der EPS umfassen, und die FISH-Quantifizierung der dominanten Schaum-Bakterien wurde an verschiedenen Schlammproben durchgeführt. Diese Proben stammten aus M. parvicella- und nocardioforme Actinomyceten-dominierten Anlagen mit Schaum-ereignissen. Zusätzlich wurde die Stoffwechselaktivität im Belebtschlamm und Schaum erfasst, um die Wachstumsstrategien und die ökologischen Nischen von M. parvicella und nocardioformen Actinomyceten zu bestimmen. Die höhere Stoffwechselaktivität der M. parvicella-dominierten Belebtschlammbiozönose im Vergleich zur Schaumbiozönose weist darauf hin, dass das Wachstum von M. parvicella im Belebtschlamm stattfindet. Die Wachstumsraten von M. parvicella werden durch die lipophilen Stoffe, welche aus dem Abwasser stammen und an die Belebtschlamm-EPS adsorbieren, gefördert. Die langen hydrophoben M. parvicella-Fäden vergrößern und hydrophobieren die Oberflächenstruktur der Belebtschlammflocke, wodurch eine stabile Adhäsion an Gasblasen stattfindet. Dadurch besitzen diese Flocken die Fähigkeit passiv an die Wasseroberfläche zu flotieren und stabile Schaumschichten zu entwickeln. Im Gegensatz dazu wurde eine höhere Stoffwechselaktivität in der Schaumbiozönose im Vergleich zur Belebtschlammbiozönose in nocardioformen Actinomyceten-dominierten ARA bestimmt. Nocardioforme Actinomyceten vergrößern ihre Populationsdichte durch aktives Wachstum in der flotierenden Schlammschicht, was für verschiedene Rhodococcus-Arten und Dietzia spp. gezeigt wurde. Diese Beobachtung wurde durch die geringe Anzahl der nocardioformen Actinomyceten im Belebtschlamm und die deutliche Anreicherung dieser Organismus in der Schaumschicht bestätigt. Der aktive Wachstumsprozess in der Schaumschicht wird von verschiedenen EPS-Komponenten wie z.B. den lipophilen Stoffe und anderen noch nicht charakterisierten Substanzen gefördert. Sowohl die hohe Anzahl von Rhodococcus spp. als auch lipophile Stoffe an der Wasseroberfläche bewirken eine Zunahme der Hydrophobizität und folglich die Entwicklung von stabilen Schäumen. Die beschriebenen Strategien zur Schaumbildung benötigen verschiedene Kontrollmaßnahmen, wobei M. parvicella direkt im Belebtschlamm bekämpft werden muss und die nocardioformen Actinomyceten in der Schaumschicht kontrolliert werden müssen. Diese Studie zeigt, dass verschiedene nocardioforme Actinomyceten-Arten, welche in der Schaumschicht nachgewiesen wurden, spezifische Wachstumsbedingungen benötigen. Deshalb sollten Bekämpfungsmaßnahmen für nocardioforme Actinomyceten-dominierte Schäume auf einer zuverlässigen taxonomischen Identifizierung auf Gattungs- und Artebene basieren.      «

Die Bildung von dickem viskosem Schaum stellt ein häufiges Problem in Abwasser-reinigungsanlagen (ARA) dar. Drei Faktoren spielen bei der Entwicklung von stabilen Schäumen eine wichtige Rolle: (i) fein verteilte Gasblasen, (ii) oberflächenaktive Substanzen und (iii) hydrophobe Stoffe. In der belüfteten Phase entstehen die Gasblasen z.B. durch Sauerstoffeintrag und initiieren die Schaumbildung. Die Grenzflächen zwischen der Gas- und Wasserphase werden durch Adsorption von oberflächenaktiven Subs...     »