Ionenkanäle sind integrale Membranproteine nahezu aller Zellen und dienen dem schnellen, selektiven Transport von Ionen entlang des elektrochemischen Gradienten. Spannungsabhängige Ionenkanäle reagieren auf eine Depolarisation mit einer Konformationsänderung, die zur Bildung einer Pore für Ionen führt. Innerhalb dieser Familie stellen Kaliumkanäle, welche selektiv permeabel für Kalium sind, die größte Gruppe mit einer Vielzahl von physiologischen Funktionen. Aufgrund der besonderen Bedeutung dieser Proteine für die elektrische Erregbarkeit von Zellen sind von verschiedensten giftigen Organismen wie z.B. Skorpionen, Schlangen oder auch Schnecken hochspezifische Toxine evolviert worden, die mit spannungsabhängigen Kaliumkanälen des Opfers interagieren. Einige dieser Toxine wurden erfolgreich zur Untersuchung der Struktur und Funktion von Ionenkanälen eingesetzt (zur Übersicht, Hille, 1992). < font face=" Symbol" > k< /font> -conotoxin PVIIA (< font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA), ein Peptid, welches aus der Fisch-fangenden Schnecke Conus purpurascens isoliert wurde (Terlau et al., 1996), blockiert sogenannte Shaker Kaliumkanäle durch eine Interaktion mit Aminosäuren, die den äußeren, extrazellulären Bereich der Pore des Ionenkanales bilden (Shon et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Blockierung des Ionenstromes durch < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA und die für die Bindung des Peptides an den Ionenkanal wichtigen Parameter untersucht. Da Ionenkanäle Konformationsänderungen während ihrer Aktivität durchführen, wurde untersucht, inwieweit dies, direkt oder indirekt, wie z.B. aufgrund von Bindung von Ionen innerhalb der Pore, die Bindung des Toxins beeinflusst. Die wesentlichen Ergebnisse dieser Untersuchung sind: < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA bindet an den Shaker Kaliumkanal mit einer 1:1 Stöchiometrie (Garcia et al., 1999; Terlau et al., 1999), die Blockierung ist jedoch für den permeierenden und nicht-permeierenden Zustand des Kanalproteins verschieden, wobei der nicht-permeierende entweder der geschlossene oder der N-Typ inaktivierte Zustand ist (Terlau et al., 1999). Die Blockierung des Kanalproteins im offenen Zustand nimmt mit höheren Testpotentialen ab. Dies lässt sich auf eine Destabilisierung der Toxinbindung aufgrund eines in der Pore gebundenen Kaliumions zurückführen: Die Dissoziation des Toxins in Anwesenheit dieses Kaliumions ist schneller und nimmt mit zunehmender Depolarisation zu. Ist Kalium das einzige permeirende Kation, so wird die Bindung von < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA an den Kanal im offenen Zustand nur durch die Zusammensetzung der intrazellulären Lösung bestimmt. Entsprechend führt die Gegenwart von nicht-permeierenden Ionen im intrazellulären Medium zu einer Erhöhung der Affinität des Toxins, die auf eine geringere Wahrscheinlichkeit der Destabilisierung des gebundenen Toxins durch Kalium zurückzuführen ist. Trotzdem ist in Gegenwart von großen, nicht-permeirenden Kationen eine Spannungsabhängigkeit in der Blockierung durch das Toxin festzustellen. Zusätzlich kann Natrium - ähnlich wie Kalium - zu einer Destabilisierung des gebundenen Toxins führen. Dies weist darauf hin, dass Natrium als schlecht permeierendes Ion (Natrium ist permeabel in Abwesenheit von Kalium) in einen substantiellen Teil der Pore eindringen kann. Da es sich bei Kaliumkanälen um sogenannte Multiionenporen handelt, ist es wahrscheinlich, dass bei Bindung des Toxins an den Ionenkanal sich mehrere Ionen in der Pore befinden können. Ferner ist wahrscheinlich, dass es sich bei dem mit der Toxinbindung wechselwirkenden Ion - in der Regel Kalium - um das Ion handelt, welches sich auf der extrazellulären Seite der Pore befindet und dass die destabilisierende Wirkung eine gleichzeitige Bewegung aller in der Pore befindlichen Ionen widerspiegelt. Die in dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine Bewegung des Ions auf der inneren Seite der Pore die Wahrscheinlichkeit des Kaliums sich in der äußeren Position zu befinden, in welcher es zu einer effektiven Abstoßung des Toxins kommt, beeinflusst. Alternativ könnte das positiv geladene Toxin auf einen bestimmten Teil des Spannungsabfalls entlang der Pore reagieren. Im Gegensatz zur Bindung an den offenen Zustand des Kanalproteins ist die Bindung von < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA an den geschlossenen Zustand ausschließlich durch die Zusammensetzung der Extrazellulärlösung determiniert. Dies weist darauf hin, dass die Wahrscheinlichkeit des Kanalproteins zu öffnen bei Bindung des Toxins an den geschlossenen Zustand sehr gering ist. Die Affinität des Toxins für den geschlossenen Zustand nimmt mit steigender Kaliumkonzentration ab, was auf eine Kalium-selektive Bindestelle in der Nähe des Toxinrezeptors hindeutet und zeigt, dass Kaliumbindung mit der Toxinbindung interferiert. Die Bindung des Toxins an das Kanalproteins ist verändert, wenn sich Rubidium als einziges permeierendes Kation auf der intra- und/oder extrazellulären Seite befindet. < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA blockiert den geschlossenen Zustand des Proteins 2-3-mal besser, wenn Rubidium anstelle von Kalium durch die Toxinbindung in der Pore eingeschlossen wird. Das komplizierte Verhalten der Toxin-Affintät bei der Blockierung des offenen Zustands des Ionenkanals in Abhängigkeit der verschiedenen getesteten ionalen Bedingungen weist darauf hin, dass nicht nur das Toxin unterschiedlich mit Rubidium und Kalium interagiert, sondern dass zusätzlich die Aufenthaltswahrscheinlichkeiten dieser Ionen innerhalb der Pore unterschiedlich ist. Verglichen mit Kalium als alleinigem permeierenden Kation ist die Blockierung des offenen Zustands des Kanalproteins in Gegenwart von Rubidium in der Extrazellulärlösung bei Rubidiumionenfluß bei 0 mV etwa 7-fach reduziert. Dieser Effekt ist unabhängig von der Zusammensetzung der Intrazellulärlösung. Unter diesen Bedingungen befinden sich wahrscheinlich zwei Rubidiumionen in der Pore, was offensichtlich der am meisten destabilisierte Zustand für die Toxinbindung darstellt. Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, dass < font face=" Symbol" > k< /font> -PVIIA erfolgreich als Probe für die Untersuchung der Permeationseigenschaften von spannungsabhängigen Kaliumkanälen eingesetzt werden kann und somit ein hilfreiches Werkzeug für das Verständnis der Pharmakologie und Physiologie von Kaliumkanälen darstellt