protein transduction; VP22; MTS; EGFP; FACS; quantification
Abstract:
Die Therapie durch Übertragung von Proteinen anstelle der für diese kodierenden Gene stellt eine Alternative zur klassischen Gentherapie dar. Verschiedene Peptidsequenzen (Proteintransduktionsdomänen, PTDs) besitzen die Eigenschaft, die normalerweise impermeable Zellmembran zu überwinden und ohne spezielle Transportersysteme oder Kanäle in Zellen einzudringen (Proteintransduktion). Durch Fusion mit diesen Sequenzen können andere, normalerweise für die Membran nicht permeable, funktionelle Peptide in beliebige Zellen eingeschleust und dadurch therapeutisch genutzt werden. Die Effizienz dieses Transports wird für die einzelnen PTDs in der Literatur jedoch kontrovers diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurde daher versucht, die Effizienz dieses interzellulären Transports der beiden PTDs VP22 und MTS durch durchflußzytometrische Analysen zu quantifizieren. Zudem sollte untersucht werden, ob sich die Effizienz des Transports durch Kombination dieser beiden PTDs innerhalb eines einzigen Peptids (VP22-MTS) verbessern lässt. Zur Untersuchung der Peptide VP22, MTS und VP22-MTS wurden Fusionsproteine aus dem fluoreszierenden Markerprotein enhanced green fluorescent protein (EGFP) und den zu testen PTDs kloniert. 48h nach Transfektion definierter Mengen DNA der zu untersuchenden Proteine in COS-7-Affennierenzellen konnte in der direkten fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der Zellen ein interzellulärer Transport nur für die PTDs VP22 und VP22-MTS gezeigt werden, nicht jedoch für MTS alleine. Durch Hinzufügen des MTS-Peptids zu VP22 wurde dessen intrazelluläre Verteilung verändert. Das Fusionsprotein VP22-MTS war bei der durchflusszytometrischen Analyse in einer signifikant (p<0,05) größeren Anzahl von Zellen bei höherer Fluoreszenzintensität nachweisbar als die beiden einzelnen Transportproteine. Im Vergleich zur Positivkontrolle konnte jedoch für keines der untersuchten Peptide ein signifikanter interzellulärer Transport nachgewiesen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass das in der Erforschung der Proteintransduktion verbreitete fluoreszierenden Markerprotein EGFP zur Quantifizierung dieses Transportvorgangs ungeeignet ist. Durch Kombination der PTDs VP22 und MTS lässt sich die Effizienz der Expression deutlich steigern, zur Verbesserung der Transporteigenschaften können jedoch keine Aussagen getroffen werden. Zur Quantifikation der Proteintransduktion ist daher die Etablierung neuer Nachweissysteme notwendig.
Translated abstract:
Treatment with proteins rather than with the genes encoding for these proteins offers an interesting alternative to classical gene therapy. Several peptides (protein transduction domains, PTDs) show the ability to cross the usually impermeable cell membrane in order to enter cells without specific transportation systems or channels (protein transduction). By fusion with these sequences other functional peptids that lack the ability to enter cells by themselves can be introduced into any type of cell and can thus be used therapeutically. However, the efficiency of this transport is discussed controversely for different PTDs. In this study therefore an attempt was made to quantify the efficiency of this intercellular transport through FACS analysis. Furthermore the transduction effiency of a peptide containing two PTDs (VP22 and MTS) was studied. To investigate the behaviour of the peptids VP22, MTS and VP22-MTS fusion proteins containing the fluorescent marker protein enhanced green fluorescent protein (EGFP) were cloned. 48 h after transfection of defined amounts of DNA of the investigated proteins into COS-7-cells, in direct fluorescent mircoscopy an intercellular spread could only be demonstrated for VP22 and VP22-MTS, but not for MTS alone. By adding the MTS-sequence to VP22 the intracellular distribution of the protein was altered. FACS analysis revealed that VP22-MTS could be detected in a significant (p<0.05) greater amount of cells at greater intensity than VP22 alone. However, in comparison with native EGFP as a positive control, an intercellular transport could not be detected for any of the fusion proteins. This study shows that EGFP, although commonly used in the investigation of protein transduction, is not suitable for examining the intercellular spread of the tested PTDs. By combination of VP22 and MTS expression efficiency can be significantly increased, however no reliable statement can be made about transduction efficiency. Therefore for the quantification of protein transduction the development of new reporter systems is neccessary.
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